Summary
Dette arbeidet presenterer en ny in vivo- modell av segmental nyreskade ved bruk av nyre GFP transgen sebrafisk. Modellen tillater induksjon av målrettet ablasjon av nyrepitelceller for å vise de cellulære mekanismer for nephron skade og reparasjon.
Abstract
Akutt nyreskade (AKI) er en vanlig medisinsk tilstand med høy dødelighet. Med nyrenes reparasjonsevner er det mulig å gjenopprette tilstrekkelig nyrefunksjon etter støttende behandling. En bedre forståelse av hvordan nephroncelledød og reparasjon oppstår på mobilnivå er imidlertid nødvendig for å minimere celledød og for å forbedre regenerativ prosess. Zebrafish pronephros er et godt modell system for å oppnå dette målet fordi det inneholder anatomiske segmenter som ligner pattedyrnefronen. Tidligere var den vanligste modellen som ble brukt til å studere nyreskade i fisk den farmakologiske gentamicinmodellen. Imidlertid tillater denne modellen ikke nøyaktig spatiotemporal kontroll av skade, og det er derfor vanskelig å studere cellulære og molekylære prosesser involvert i nyrereparasjon. For å overvinne denne begrensningen presenterer dette arbeidet en metode som, i motsetning til gentamicin-tilnærmingen, et spesifikt Green Fuorescent Protein (GFP) -exempelTrykke nephron segmentet kan fotograferes ved hjelp av et violet laserlys (405 nm). Denne nye modellen av AKI gir mange fordeler som andre metoder for epitelskader mangler. Dens viktigste fordeler er muligheten til å "ringe" nivået av skade og den nøyaktige spatiotemporal kontrollen i den robuste in vivo dyremodellen. Denne nye metoden har potensial til å øke forståelsesnivået for nyreskade og reparasjonsmekanismer betydelig.
Introduction
Akutt nyreskade (AKI) 1 , 2 , som også kan refereres til som akutt nyresvikt, er i stor grad definert som en plutselig nedsatt nyrefunksjon 3 . Selv om forståelsesnivået for denne tilstanden har blitt forbedret bemerkelsesverdig gjennom årene, har morbiditet og dødelighet vært høyt 1 , 2 . Den nåværende behandlingen for denne tilstanden er for det meste støttende, da resultater fra flere kliniske studier av medisinbehandling har vært negative 4 , 5 . Nyren er unik fordi den har evnen til å reparere seg selv. Derfor er støttende terapi etter en tidlig diagnose av AKI den beste måten å begrense sykelighet 6 . Det er imidlertid vanskelig å oppdage AKI tidlig, og dødeligheten er en svimlende 50-80% for de som trenger dialyse 5. Med nyrenees evne til å reparere seg selv og mangel på behandlingsmuligheter for denne tilstanden, er det viktig å utvikle metoder for å forbedre denne nephronregenerasjonsprosessen.
Det har vært mange forskjellige modeller brukt til AKI-forskning som inkluderer forskjellige agenter for skade- og dyremodeller. Når det gjelder agenter for nyreskader, har aminoglykosid antibiotisk gentamicin blitt brukt som et nefrotoksisk middel som fører til AKI 7 , 8 . Imidlertid har flere grupper funnet at gentamicinbehandling er dødelig for sebrafiskembryoen 9 . Det forårsaker tubulær skade som er for alvorlig for embryoutvinning, noe som gjør studien av regenerering vanskelig uten noen form for inngrep. Mammaliske modeller, som mus og rotte, anses også verdifulle, men de står overfor mange begrensninger under studiet av AKI. Kanskje den største ulempen ved gnagermodeller er vanskeligheten i visuaLizing gnagere nyre og dermed bestemme de presise spatiotemporal prosessene som fører til epiteldød og reparasjon.
Johnson et al. Har rapportert en laserablasjonsbasert teknikk for å indusere akutt nyreskade i embryonale og larvezebrafisk 9 . De brukte pulserende laserablation for å skade nyrene etter en intramuskulær injeksjon med dextran-konjugater. Fluorescensen fra dextran-konjugater muliggjør visualisering av skade og regenerering i tubuleepitelet 9 . Denne modellen overvinter de to begrensningene nevnt ovenfor, men det tillater ikke graderte nivåer av skade og er vanskelig å utføre på store, vilkårlig cellegrupper.
Den nye laserablasjonsbaserte sebrafiskmodellen av AKI som beskrives her, adresserer alle ovennevnte begrensninger. Den pronephriske nyre i zebrafisk larver er et modent, fungerende organ som inneholder segmenter som ligner pattedyren nePhron, inkludert en glomerulus, proksimal og distal tubuli, og en samlingskanal 10 . Sebrafisk larver er også optisk gjennomsiktige, noe som gjør det mulig å observere nyrene gjennom fluorescens teknikker. Således er sebrafisk en verdifull in vivo- modell av AKI, og larval pronephric nyre (5-12 dager-postbefruktning (dpf)) kan brukes til å studere de cellulære og molekylære prosessene som er involvert i nyreskade og reparasjon.
Dette papiret presenterer en metode der spesifikke grønne fluorescerende proteiner (GFP) -uttrykkende nefron-segmenter kan bli fotografert ved hjelp av et lavt energiforbruk (sammenlignet med et pulserende lasersystem) violet laserlys (405 nm). GFP-fluorescensen tillater målretting av en gruppe celler, noe som gjør endringene som forekommer synlige gjennom observasjon av GFP-fotoblekking. I tillegg tjener GFP (ved å absorbere fiolett lys) som en energisynk til å potensere skaden i GFP-uttrykkende nyreceller. Time-lapse-mikroberKopi kan da brukes til å studere reparasjonsprosessen. Studier har funnet celleproliferasjon, cellemigrasjon og cellemetaplasi 11 , 12 , 13 til alle potensielle prosesser som kan spille en viktig rolle i nyrereparasjon. Den relative betydningen av disse prosessene og detaljene i samspillet har imidlertid vært vanskelig å avdekke på grunn av begrensningene i eksisterende modeller av AKI. Ved hjelp av denne nye tilnærmingen, var det mulig å vise at cellemigrasjon spiller en sentral rolle i nyrereparasjon etter akutt skade 14 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne studien ble utført i samsvar med anbefalingene i veiledningen for pleie og bruk av laboratoriedyr i National Institutes of Health. Protokollen ble godkjent av NYIT College of Osteopathic Medicine Institutional Animal Care and Use Committee (NYITCOM IACUC). All kirurgi og in vivo- eksperimenter ble utført under tricalinbedøvelse, og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse.
1. Oppnå og vedlikeholde embryoer
- Få embryoer ved å krysse nyre GFP fluorescerende sebrafisk.
MERK: Eksempler på fluorescensmerket zebrafisk-transgene linjer er oppført i tabell 1 . - Hold embryoene ved 28,5 ° C i E3-løsning i løpet av 24 timer etter befruktning.
- Etter 24 timer byttes mediet med en E3-løsning som inneholder 0,003% 1-fenyl-2-tiourea (PTU).
MERK: PTU brukes fordi den blokkerer de tyrosinaseavhengige trinnene i melanogeneseOg forhindrer dermed pigmentering. Her blir denne løsningen referert til som E3-PTU. - Øk de befruktede embryoene ved 28,5 ° C til de er> 6 dpf, hvor nyrene har modnet.
MERK: Det er best å bruke larver i 7-9 dpf-vinduet. - Ved hjelp av et fluorescerende disseksjonsmikroskop ved 40X forstørrelse og grønt fluorescens-utslippsfiltre, velg larver med lys nyre-GFP-fluorescens.
2. Montering av Zebrafish for Live-bildebehandling
- Hvis du fotograferer embryoene før 3 dpf, fjerner du choronen fra uoppdaget sebrafisk før du monterer sebrafisken for avbildning.
- Manukt dekarinat med tang (foretrukket) eller bruk en kjemisk behandling med en protease blanding.
MERK: Dekkerinering gir de beste bildesultatene.
- Manukt dekarinat med tang (foretrukket) eller bruk en kjemisk behandling med en protease blanding.
- Skyll chorionsruskene i petriskålen ved hjelp av E3-PTU-oppløsning og fyll på parabolen med E3-PTU.
- behandling anleggRe 1-2% lavmeltingspunkt (LMP) agarose med 0,2 mg / ml tricaine løsning for å montere zebrafisken for nyrefotoablation og levende bildebehandling.
- Hvis LMP-agarose allerede var forberedt på forhånd, oppvarmes det i mikrobølgeovnen for å smelte den.
- Når LMP-agarosen er tilberedt, sett en 35 mm plast petriskål på et disseksjonsmikroskop. Plasser en låsesonde i nærheten for å orientere de bedøvede larvene riktig.
MERK: Det er viktig å gjøre dette trinnet i tide og å ha alt på plass, fordi embryoene må være orientert før agarosen stivner i løpet av 1-3 min. - Før du overfører embryoet til agarosen, må du sørge for at agarosen er kult ( dvs. ved kroppstemperatur). Bruk en plast- eller glassoverføringspipette for å plassere embryoen i den nedkjølte smeltet agarose-tricaine-løsningen.
MERK: Dette gjøres fordi agarose som er for varmt kan være skadelig for embryoet, noe som fører til hjertestansEller død - Ved hjelp av en overføringspipette, redra embryoen i agaroseoppløsningen og plasser embryoet / larven midt på en 35 mm tallerken.
- Spred agarosen som inneholder embryoen / larven raskt for å dekke bunnen av 35 mm fatet jevnt; Det beste volumet av agarose å bruke er ~ 1-1,1 ml.
- Bruk glassproben til å orientere embryoen på best mulig måte for fotoablation og avbildning.
MERK: Film 1 viser den beste orienteringen til embryoen / larven for ensidig fotoablation. Dette trinnet er mest tidsfølsomt og bør utføres raskt før agarosen begynner å gel, da ethvert forsøk på å omorientere fisken etter at gelering begynner, er skadelig.- Orienter larven slik at nyresegmentet av interesse er vinkelrett på strålebanen mens kontralateralsegmentet er borte fra laserstrålen (se film 1 ).
MERK: Dette kan oppnås ved å dreie larven som vist i Film 1 . - La ca 15 minutter for agarose å størkne. Dekk petriskålen for å minimere fordampning. Når agarosen har størknet, er embryoen eller larven klar for fotoablation.
3. Laserablation
- Operere det konfokale bildesystemet.
MERK: Ved bruk av den refererte bildeplattformen (se materialetabellen), inkluderer de anbefalte innstillingene 40X forstørrelse, en 0,8 NA vanndypningslins og det første dikroiske speilsettet for å tillate både 488 og 405 nm belysning av prøven. Deteksjonen skal utføres på den grønne kanalen. - Plasser fatet som inneholder immobilisert sebrafisk i et konfokalt stadium.
MERK: Denne prosedyren er optimalisert for oppreist konfigurasjon ved hjelp av en 40-60X vanndypende linse. Det bør imidlertid være mulig å endre prosedyren for et invertert mikroskop. - I oppreist konfigurasjon, plasser petriskålen som inneholder embryoet på toppen av en mikroskopOpe lysbilde og hold den på plass ved hjelp av modellering leire (for eksempel plasticine). Plasser glassruten med petriskålen på scenen av konfokalmikroskopet.
- Tilsett 3 ml av bildeløsningen E3-PTU (se trinn 1.3) med 0,2 mg / ml tricain.
MERK: Bildeløsningen kan også legges til umiddelbart før du legger lysbildet på scenen. Tillegg av bildebehandling bør gjøres svært nøye for å hindre at agarosen flyter fra bunnen av fatet. - Bytt til vanndypningslinsen (40 eller 60X). Løft stadiet langsomt, og sørg for at linsen er litt vinklet for å hindre at luften blir fanget i strålebanen. Når linsen berører løsningen i en vinkel, senter den slik at den ligger innenfor synsfeltet.
- Finn segmentet av interesse ved bruk av fluorescens lyskilden. Plasser overflaten målrettet mot skade for å minimere lysfordeling (se film 1 ).
MERK: The subsequenT trinnene gjør bruk av referert programvare (se Materialetabellen), men prosedyren kan enkelt tilpasses til andre plattformer. - Åpne programvaren. Naviger til "View" | "Oppkjøpskontroll" | "C2plus Compact GUI" og sett "pixel dwell time" til "1.9 μs," "ramme størrelse" til "512 x 512 piksler" og "pinhole størrelse" til "90 μm." Sett "405 nm (eller 408 nm i noen systemer) laserintensitet" til null og "488 laserintensitet" til "lav" (helst <1%). Juster "gain" for å oppnå et godt dynamisk område, men ikke for å mette signalet.
MERK: Disse verdiene er ikke kritiske og brukes til konsistens. Når en 405 nm laser brukes, vil det resultere i økning i GFP fluorescens. For å unngå metning av signalet under fotoblekking (trinn 3.11), må signalverdien bli nedskalert på den grønne kanalen. Den blå kanalforsterkningen kan stå på null, da den ikke brukes til sampling. - Klikk "Scan" i programvaregrensesnittet for å skanne nyrene ved hjelp av en 488 nm laser. Finn segmentet av interesse som er vinkelrett på strålebanen, og det er godt visualisert, med god GFP-fluorescens. Når den regionen er blitt identifisert, tegne en region av interesse ved hjelp av en elliptisk region-of-interest (ROI).
- Naviger til "ROI" | "Tegn elliptisk avkastning."
MERK: Dette brukes til kontinuerlig måling av gjennomsnittlig GFP-intensitet mens fotoblekking foregår, slik at det blir mulig å administrere en nøyaktig dose laserbehandling.
- Naviger til "ROI" | "Tegn elliptisk avkastning."
- Naviger til "View" | "Oppkjøpskontroller" | "C2plus Scan Area" og velg "Band Scan Area." Den rektangulære masken vises innenfor dette grensesnittet. Definer manuelt et rektangulært skanningsvindu ved hjelp av markøren ( dvs. dra, endre størrelsen og skru masken) for å dekke segmentet som er målrettet for laserablation. Høyreklikk iMaskeområde for å godta valget.
MERK: Bare det valgte området blir skannet. - Start tidsmåling mens du overvåker den grønne kanalen ved hjelp av bare 488 nm laseren for å aktivere GFP. Kontroller at intensiteten til 488-laseren er relativt lav (~ 1%). Mål gjennomsnittsintensiteten til GFP i interessepunktet ved å velge "Mål" | "Tidsmåling". Bruk "Graf" eller "Data" -fanene til å overvåke gjennomsnittlige intensitetsverdier innenfor avkastningen.
MERK: Oppkjøpshastigheten er definert ved pikseloppholdstid og størrelsen på det rektangulære vinduet som er angitt i trinn 3.9, men generelt muliggjør den rask overvåking av signalet (~ 2-10 bilder / s). - Inducer skade på nyrene celler med violet laser (405 nm) ved å øke intensiteten til 100% ved å skyve "laser power" kontroll helt til høyre. 488 nm laseren kan forbli aktiv hvis intensiteten er lav.
- Følg en linje gRaph ved hjelp av "Graph" -fanen eller de numeriske verdiene for GFP intensitet ved hjelp av "Data" -fanen og vent til den faller til ønsket nivå, for eksempel 50% av basislinjen (som vist i Figur 1 ).
MERK: En 20 mW laser har blitt brukt som en del av den refererte laserenheten (se Materialetabellen ); Maksimal intensitet kan variere mellom systemer. Lavere intensitet kan kompenseres ved lengre eksponering ( dvs. ved å bruke prosent GFP-bleking som et mål for total eksponering).
- Følg en linje gRaph ved hjelp av "Graph" -fanen eller de numeriske verdiene for GFP intensitet ved hjelp av "Data" -fanen og vent til den faller til ønsket nivå, for eksempel 50% av basislinjen (som vist i Figur 1 ).
- Når GFP-intensiteten i den elliptiske avkastningen (trinn 3.8) har gått ned til ønsket nivå, reduserer du umiddelbart intensiteten til den violete (405 nm) laseren til "0" ved å flytte glidebryteren "laser power" helt til venstre i Programvare kontrollpanelet.
- Oppnå en ny grunnlinje for GFP fluorescens. Bekreft ablationen ved å oppnå et forhold på X / Y.
MERK: Se figur1B; Y = gjennomsnittlig intensitet før ablationen og X = gjennomsnittlig intensitet etter ablationen, ved bruk av et gjennomsnitt på 4 påfølgende prøver i avkastningen. Det eksakte målforholdet (50%, 60%, etc. ) avhenger av mengden skade som er ønsket for et gitt eksperiment.
- Oppnå en ny grunnlinje for GFP fluorescens. Bekreft ablationen ved å oppnå et forhold på X / Y.
4. Time-lapse-mikroskopi med propidiumjodid-farging
- Påfør generelle tidsforsinkelseshensyn (skissert i en tidligere studie 15 ) for å visualisere propidiumjodidfarging som et korrelat av nyrecellskade etter fotoablation.
- Før inkuber larvene i 30 μM propidiumjodidoppløsning (1% DMSO i E3-PTU) i 3 timer før embedding og fotoablation, som beskrevet i trinn 2 og 3,7.
MERK: Ingen ekstra propidiumjodid er nødvendig i agarosen eller bildebehandlingsløsningen. - Inducerer segmental nyreskade, som beskrevet i trinn 3.1-3.12.
- Skaff timelapse bildestabler, som beskrivelsenSeng i en tidligere studie 14 , ved hjelp av en 488 nm laser (GFP) og en 461 nm laser (Propidium Iodide, PI).
MERK: De to fargene er overlappet i konfokale stabler for å korrelere forsvinden av GFP og utseendet av propidiumjodidfarging. - Angi parametrene for å skaffe time-lapse-bildestablene som følger: virtuell skivetykkelse = 4 μm, z-stabellintervall = 2 μm, pikseloverholdstid = 1,9 μs, bildedimensjoner = 512 x 512 og gjennomsnittlig = 2.
MERK: Disse parametrene tillater kontinuerlig, 10 til 15 minutters intervallopptak av opptil 4 larver og sørger for at det er minimal fotoblekking av prøven. - Bruk bildebehandling programvare kompatibel med opptak filformat for å visualisere og analysere dataene.
- Orienter larven slik at nyresegmentet av interesse er vinkelrett på strålebanen mens kontralateralsegmentet er borte fra laserstrålen (se film 1 ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vær oppmerksom på at denne protokollen ble vellykket brukt med en rekke transplantatlinjer av nyre GFP, inkludert ET (krt8: EGFP) sqet11-9, ET (krt8: EGFP) sqet33-d10 og Tg (atp1a1a.4: GFP). Eksempelresultatene vist her ble oppnådd ved bruk av ET (krt8: EGFP) sqet11-9-linjen.
Figur 1 viser eksemplet photoablation protokoll. Den gjennomsnittlige GFP intensiteten overvåkes innenfor interessepunktet ( Figur 1A og Film 1 ). Et eksempel på gjennomsnittlig intensitetsspor er vist i figur 1B .
Som vist i figur 2 , fortsetter GFP-fluorescens etter eksponering for 405 nm laserlys å forsvinne en celle om gangen til, på 220 minutter, mister hele ablated-segmentet 100% av sin GFP-positivitet. Dette tapet av GFP fLuorescens skyldes faktisk celledød og ikke for eksempel nedregulering av GFP-uttrykk. Dette fremgår av utseendet av røde fluorescerende propidiumjodid-positive kjerner i cellene som mister GFP-positivitet.
Omfanget av celledød kan vurderes ved å måle gjennomsnittlig GFP-fluorescens i det ablaterte segmentet og sammenligne det med den gjennomsnittlige GFP-intensiteten umiddelbart fremre og bakre til det ablaterte segmentet. Figur 3 viser sammenhengen mellom omfanget av lasereksponering (målt ved den første mengden av fotoblekking) og omfanget av celledød i det eksponerte segmentet. Det viser at ved å variere den første eksponeringen, er det mulig å "ringe" skaden og responsen til det skadede epitelet. Med 10-20% av den første GFP-fotoblekking observeres praktisk talt ingen reduksjon av GFP-positivitet ved 5 timer etter skade. 50 og 60% fotoblekking fører til en fullstendig forsømmelseAran av GFP på 5 timer, mens 30 og 40% bleking fører til mellomliggende resultater, med 50% estimert død observert ved ca. 35% fotoblekking. Disse resultatene støttes av PI-farging ( figur 3B ). 20% fotobleking resulterer i nesten ingen PI-farging ved 100 minutter etter ablasjon. 50% fotobleaching fører til kontinuerlig PI-positivitet i det ablaterte epitelet etter 60 minutter, mens 30 og 40% fotobleking fører til mellomliggende PI-inkorporering. Som det fremgår av disse dataene, tillater denne metoden innføring av graderte mengder av epithelial skade og for studiet av epithelial responsen til dødelig og sublodal epitelskade.
Figur 1: Photoablation Prosedyre. ( A ) Skjematisk viser embryo / larve orientering, laser eksponering, og region-of-interest (ellipse) målingUrement av den gjennomsnittlige fluorescens for å overvåke mengden av GFP-fotoblekking; Se film 1. Den rektangulære boksen viser skanningsvinduet. ( B ) Et eksempel på en faktisk region av interesse gjennomsnittlig GFP intensitetssporing før, under og etter 405 nm laser eksponering. Gjennomsnittlig GFP-intensitet på fire påfølgende målinger (vist i grønne bokser) vises før (Y) og etter (X) fotoablationen. Forholdet X / Y brukes som et mål for total lyseksponering og er plottet på X-aksen i figur 3 . Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Epitelcelle død etter 405 nm laser eksponering. Eksempel på sekvensielle rammer som viser forsvinner av GFP anD utseendet av propidiumjodidfarging etter fotoablation (40% første fotobryting). Rammerne er på 0, 130, 170 og 220 min etter at lyset har blitt brent (405 nm). Forsvinnelsen av GFP sammenfaller med utseendet av rød fluorescerende PI-kjernevirksomhet. Vær oppmerksom på at PrI-fluorescens oppdages ved å bruke den røde kanalen. Den røde fluorescensen sett utenfor nyren skyldes kromoforer og tilstedeværelsen av PI i tarmen. Skalbjelke = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Doseringsrespons av epithelial skade til mengden fotoablation. ( A ) Photoablation måles med prosent av initial reduksjon i GFP fluorescens i eksponeringenEd segmentet. Dette sammenlignes med nedgangen i gjennomsnittlig GFP-fluorescens i det skadede segmentet ved 5 timer etter skade. Denne måling normaliseres til gjennomsnittlig mengde fluorescens oppstrøms og nedstrøms for det skadede segmentet. Måldoser var 10, 20, 30, 40, 50 og 60% av den opprinnelige photobleaching. De faktiske mengdene er litt større, noe som utgjør 14,8, 24,4, 33,8, 45,4, 56,5 og 62,1% fotobleaching, noe som resulterer i 85,2, 75,6, 66,2, 54,6, 43,5 og 37,9% gjenværende fluorescens, n = 2 - 6 / mål gruppe. Feilstengene representerer standardavviket langs X (prosent av gjenværende fluorescens umiddelbart etter fotoablation) og Y (prosent av gjenværende fluorescens 5 timer etter fotoablation) akser. ( BE ) PI-farging parallellerer den totale forsvinningen av GFP-positivitet. Nesten ingen PI-farging observeres ved 20% (80% gjenværende fluorescens) fotoblekking ved 100 min etter laser eksponering ( B , høyre panel). ( C og
| transgen | Uttrykksmønster | referanser |
| Tg (wt1b: GFP) | Glomerulus, noen PT | [11] |
| Tg (atp1a1a.4: GFP) | Distal til glomerulus | [12] |
| Tg (cdh17: GFP) | Distal til glomerulus | [9,10] |
| Tg (ret1: GFP) | Sen DT, PD | [1. 3] |
| Tg (enpep: GFP) | Distal til glomerulus | [14] |
| Tg (CD41: GFP) | Multikilierte celler | [15] |
| ET (krt8: EGFP) sqet11-9 | Rett PT, tidlig DT | [16,17] |
| ET (krt8: EGFP) sqet33-d10 | Konvolutert PT | [16,17] |
| PT = proksimal tubule | ||
| DT = Distal Tubule | ||
| PD - Pronephric Duct |
Film 1: Animasjonsoppsummering av Photoablation Procedure. I den første delen av filmen vises riktig embryo / larvorientering. De to nyregrenene er vist i grønt. En glassprobe brukes til å orientere fisken i agarose. Dette gjøres hvis en kontroll, ikke-skadet gren er ønsket. Fiske fisken tillater laser eksponering på bare en gren av pronephric nyre. I den andre delen av filmen er laserabliseringsprosedyren skissert. Ellipsen indikerer regionen av interesse innenfor segmentet som gjennomgår ablation, som brukes til å overvåke mengden av innledende photobleacHing. Det rektangulære vinduet tillater nøyaktig justering av størrelsen og plasseringen til det ablaterte segmentet. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det bør bemerkes at den totale laserkraften varierer mellom systemene. Ved bruk av prosent GFP-fotoblekking gjør det imidlertid mulig å lese ut den totale energien som leveres til fluorescerende nyre, uavhengig av variasjonen i laserkraft og kompenseres av lengden av eksponeringen. Vær imidlertid oppmerksom på at responsen til forskjellige vev til denne metoden for fotoablation varierer. Selv under nyrefruktur er det betydelig vanskeligere å få en 50% reduksjon i GFP-fluorescens hos yngre embryoer enn i modne larver. Disse forskjellene i vevsresponsivitet til fotoablation bør tas i betraktning når du endrer og tilpasser denne protokollen til forskjellige applikasjoner. Således er det kritisk å overvåke prosentvis reduksjon i GFP-fluorescens for å korrekt måle mengden skade og den forventede responsen til det skadede nyrepitelet.
De viktigste fordelene ved denne metoden sammenlignet med andre metoder for nyreskade iSebrafisk er det som muliggjør nøyaktig kontroll av skadens spatiotemporelle plassering. Også, det tillater forskere å ringe nivået av skade opp og ned. Denne muligheten til å kontrollere mengden av skade bør tillate undersøkelse av responsene til epitelceller og skal bistå med beslutningstaking når det gjelder utvinning mot apoptose mot nekrose. For eksempel er det mulig å vise at cellemigrasjon er et første respons av overlevende epitel til segmental ablation, og at celleproliferasjon er en sekundær prosess, sannsynligvis drevet av mekaniske krefter generert ved cellemigrasjon 14 .
Foruten muligheten til å studere reparasjonsprosessen på mobilnivå, er det andre fordeler med denne metoden. For det første hadde tidligere fotoablationsteknikker begrenset kontroll over mengden fotodamasje 9 . Denne modellen tillater imidlertid en gradvis kontroll over mengden av skade, noe som gjør det lettere åGjennomføre fremtidige studier. I tillegg, i denne tilnærmingen er det mulig å målrette vilkårlig grupper av GFP fluorescerende celler, slik at det blir mulig å lett ablasjon av hele segmenter. Selv om dette kunne oppnås med pulserende laserteknikk, er det mer arbeidskrevende, og begrenser potensialet for eksperimentell design. Bruken av GFP for å målrette og forsterke epitelskader er en ytterligere fordel, fordi det er så mange GFP-transgene zebrafisk tilgjengelig ( tabell 1 er bare en delvis liste). Andre fluorescerende proteiner uttrykt av transgene arter har også blitt undersøkt, for eksempel Killer rødt protein, men disse transgene transgene er ikke allment tilgjengelige 16 . En ytterligere fordel ved å bruke GFP er at med forskjellige laserbølgelengder kan GFP-uttrykk brukes enten til fotoablation (405 nm) eller avbildning (488 nm). Det skal imidlertid bemerkes at metoden publisert av Johnson et al. 9 kan brukes til ikke-fluorescerendeSebrafisk og dermed kan brukes i større grad enn denne tilnærmingen.
En annen begrensning for denne laserablationsmodellen er at den ikke tar hensyn til alle de forskjellige faktorene som kan føre til menneskelig AKI. Det kan være en kjede av hendelser som fører til celle nekrose i menneskekroppen, samt celle apoptose som er indusert under nyre skader. Det er uklart om det forskjellige miljøet som produseres under laserablation kan etterligne alle aspekter av AKIs patofysiologi hos mennesker 10 . Ikke desto mindre har denne laserablationsmodellen mange fordeler i forhold til de alternative modellene. Ved å tillate studier av nyrecelledød og reparasjon med høy oppløsning i sanntid, bør denne metoden føre til en bedre forståelse av nyre-reparasjonsmekanismer og legge grunnlag for nye tilnærminger til AKI-behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Dr. Iain Drummond og Dr. Vladimir Korzh for å dele nyre GFP transgene linjer. Vi vil også takke NYITCOM for å gi nødvendige ressurser til å utføre dette arbeidet. Denne studien ble delvis støttet av tilskudd: K08DK082782, R03DK097443 (NIH) og HSCI Pilot Grant (AV).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri Dishes, 35 x 10 mm | Genesee Scientific | 32-103 | Procedural Usage: Step 2.4, 2.7 |
| Petri Dishes, 100 x 15 mm | Midwest Scientific | 910 | Procedural Usage: Step 1 |
| Dechorination forceps - Electron Microscopy Sciences Dumont Tweezers 5 Dumostar | Fischer Scientific | 50-241-57 | Procedural Usage: Step 2.1.1 |
| Plastic Transfer Pipet | Globe Scientific | 135030 | Procedural Usage: Step 2.5, 3.6 |
| Tricaine | Sigma Aldrich | A5040-25G | Procedural Usage: Step 2.3, 3.4 |
| Agarose | Fischer Scientific | BP165-25 | Procedural Usage: Step 2.3 |
| Pulled glass probe (manufactured manually from glass capillary tubes) | Fischer Scientific | 21-1640-2C | Procedural Usage: Step 2.4 |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1270 | Procedural Usage: Step 1.5 |
| SOLA Light Engine | Lumencor | SOLA SM-5-LCR-SB | Procedural Usage: Step 1.5 |
| Eclipse C2 Plus Confocal Microscope System | Nikon | Procedural Usage: Step 3 | |
| 1x E3 Solution | Recipe used to generate: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2 , 0.33 mM MgSO4 Procedural Step Usage: 1.2, 1.3, 2.2, 2.3 | ||
| PTU | Sigma | P7629-10G | Procedural Step Usage: 1.3, 2.2, 3.4, 4.2 |
| NIS Elements Software | Nikon | C2+ | Procedural Usage: Step 3 |
| Laser Unit | Agilent | MLC 400 | Procedural Step 3.11 |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma Aldrich | P4170-100MG | Procedural Step Usage: 4.2 |
References
- Chertow, G. M. Acute Kidney Injury, Mortality, Length of Stay, And Costs In Hospitalized Patients. J Am Soc Nephrol. 16 (11), 3365-3370 (2005).
- Yasuda, H., et al. Incidence And Clinical Outcomes of Acute Kidney Injury Requiring Renal Replacement Therapy In Japan. Ther Apher Dial. 14 (6), 541-546 (2010).
- Waikar, S. S., Liu, K. D., Chertow, G. M. Diagnosis, Epidemiology And Outcomes of Acute Kidney Injury. Clin J Am Soc Nephrol. 3 (3), 844-861 (2008).
- Lameire, N., Van Biesen, W., Vanholder, R. Acute Kidney Injury. The Lancet. 372 (9653), 1863-1865 (2008).
- Esson, M. L. Diagnosis And Treatment of Acute Tubular Necrosis. Ann Intern Med. 137 (9), 744 (2002).
- Vaidya, V. S., Ferguson, M. A., Bonventre, J. V. Biomarkers of Acute Kidney Injury. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 48 (1), 463-493 (2008).
- Hentschel, D. M. Acute Renal Failure In Zebrafish: A Novel System To Study A Complex Disease. Am J Physiol Renal Physiol. 288 (5), F923-F929 (2005).
- Cianciolo Cosentino, C., et al. Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae To Study Acute Kidney Injury. J Vis Exp. (42), (2010).
- Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser Ablation of The Zebrafish Pronephros To Study Renal Epithelial Regeneration. J Vis Exp. (54), (2011).
- Drummond, I. A., Davidson, A. J. Zebrafish Kidney Development. Methods Cell Biol. , 233-260 (2010).
- Toback, F. G. Regeneration After Acute Tubular Necrosis. Kidney Int. 41 (1), 226-246 (1992).
- Witzgall, R., et al. Localization of Proliferating Cell Nuclear Antigen, Vimentin, C-Fos, And Clusterin In The Postischemic Kidney. Evidence For A Heterogenous Genetic Response Among Nephron Segments, And A Large Pool of Mitotically Active And Dedifferentiated Cells. J Clin Invest. 93 (5), 2175-2188 (1994).
- Bonventre, J. V. Dedifferentiation And Proliferation of Surviving Epithelial Cells In Acute Renal Failure. J Am Soc Nephrol. 14 (90001), (2003).
- Palmyre, A., et al. Collective Epithelial Migration Drives Kidney Repair After Acute Injury. PLoS ONE. 9 (7), e101304 (2014).
- Vasilyev, A., Drummond, I. A. Live Imaging Kidney Development In Zebrafish. Methods Mol Biol. , 55-70 (2012).
- Korzh, V., et al. Visualizing Compound Transgenic Zebrafish In Development: A Tale of Green Fluorescent Protein And Killerred . Zebrafish. 8 (1), 23-29 (2011).
- Bollig, F., Mehringer, R., Perner, B., et al. Identification and comparative expression analysis of a second wt1 gene in zebrafish. Dev Dyn. 235 (2), 554-561 (2006).
- Liu, Y., Pathak, N., Kramer-Zucker, A., Drummond, I. A. Notch signaling controls the differentiation of transporting epithelia and multiciliated cells in the zebrafish pronephros. Development. 134 (6), 1111-1122 (2007).
- Diep, C. Q., Ma, D., Deo, R. C., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470 (7332), 95-100 (2011).
- Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebra fish. Am J Physiol. 299 (5), F1040-F1047 (2010).
- Fisher, S., Grice, E. A., Vinton, R. M., Bessling, S. L., McCallion, A. S. Conservation of RET regulatory function from human to zebrafish without sequence similarity. Science. 312 (5771), 276-279 (2006).
- Seiler, C., Pack, M. Transgenic labeling of the zebrafish pronephric duct and tubules using a promoter from the enpep gene. Gene Expr Patterns. 11 (0), 118-121 (2011).
- Lin, H. F., Traver, D., Zhu, H., et al. Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish. Blood. 106 (12), 3803-3810 (2005).
- Choo, B. G., Kondrichin, I., Parinov, S., et al. Zebrafish transgenic Enhancer TRAP line database (ZETRAP). BMC Dev Biol. 6 (1), 5 (2006).
- Parinov, S., Kondrichin, I., Korzh, V., Emelyanov, A. Tol2 transposon-mediated enhancer trap to identify developmentally regulated zebrafish genes in vivo. Dev Dyn. 231 (2), 449-459 (2004).
