Summary
Les cellules neuronales de la souris cultivées sur des matrices multi-électrodes affichent une augmentation de la réponse suite à une stimulation électrique. Ce protocole démontre comment culture des neurones, comment enregistrer l'activité et comment établir un protocole pour former les réseaux pour répondre aux modèles de stimulation.
Abstract
Les tableaux de micro-électrodes (MEA) peuvent être utilisés pour étudier la toxicité du médicament, les paradigmes de conception pour la médecine personnalisée de prochaine génération et étudier la dynamique du réseau dans les cultures neuronales. Contrairement aux méthodes plus traditionnelles, comme le patch-clamping, qui ne peuvent enregistrer que l'activité à partir d'une seule cellule, les MEA peuvent enregistrer simultanément à partir de plusieurs sites dans un réseau, sans nécessiter la tâche ardue de placer chaque électrode individuellement. En outre, de nombreuses configurations de contrôle et de stimulation peuvent être facilement appliquées dans la même configuration expérimentale, ce qui permet d'explorer une large gamme de dynamiques. L'une des principales dynamiques d'intérêt pour ces études in vitro a été la mesure dans laquelle les réseaux cultivés affichent des propriétés indicatives de l'apprentissage. Les cellules neuronales de la souris cultivées sur les AME affichent une augmentation de la réponse suite à une formation induite par une stimulation électrique. Ce protocole démontre comment faire la culture des cellules neuronales sur les AME; Re re reCordon de plus de 95% des plats plaqués; Établir un protocole pour former les réseaux pour répondre aux modèles de stimulation; Et trier, tracer et interpréter les résultats de ces expériences. L'utilisation d'un système exclusif pour stimuler et enregistrer des cultures neuronales est démontrée. Les packages logiciels sont également utilisés pour trier les unités neuronales. Une interface utilisateur graphique personnalisée est utilisée pour visualiser les histogrammes temporels post-stimulus, les intervalles inter-éclatement et la durée de l'éclatement, ainsi que pour comparer la réponse cellulaire à la stimulation avant et après un protocole de formation. Enfin, les résultats représentatifs et les orientations futures de cet effort de recherche sont discutés.
Introduction
Les tableaux de microélectrolyse (MEA) peuvent être utilisés pour étudier la toxicité du médicament, les paradigmes de conception pour la médecine personnalisée de prochaine génération et étudier la dynamique du réseau dans les cultures neuronales 1 . Contrairement aux méthodes plus traditionnelles, telles que le patch-clamping, qui ne peuvent enregistrer que l'activité à partir d'une seule cellule, ou enregistrer sur le terrain avec une pipette en verre, qui peut enregistrer des réponses extracellulaires des neurones entourant l'électrode sur un seul site, les MEA peuvent simultanément Enregistrer à partir de sites multiples dans une culture cellulaire sans nécessiter la tâche ardue de placer chaque électrode individuellement. Cela permet d'étudier les interactions dynamiques entre les groupes de cellules qui forment un réseau au sein de cette culture. En outre, les effets de la stimulation électrique sur les modèles de tir de réseau 2 , 3 , 4 , 5 et le contrôle du réseau 6 </ Sup> dans les cultures neuronales ont été bien documentées, et de nombreuses configurations de stimulation électrique et de contrôles peuvent être facilement appliquées dans la même configuration expérimentale, ce qui permet d'explorer une large gamme de dynamiques spatio-temporelles.
L'une des principales dynamiques d'intérêt pour ces études in vitro a été la mesure dans laquelle les réseaux cultivés affichent des propriétés indicatives d'apprentissage 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . Le Laboratoire Peixoto a précédemment examiné les effets des signaux de formation à haute fréquence, comme décrit dans Ruaro et al. 14 , sur des réseaux de neurones de souris plaqués sur des tableaux de microélectrodes 15 . Dans ces expériences, les réseaux affichent une augmentation de la réponse suiteG formation induite par la stimulation électrique. La réponse accrue a été considérée comme une forme d'apprentissage grâce à la reconnaissance de stimulus, grâce à laquelle les réseaux ont répondu de manière cohérente à un changement de stimulus après l'application d'un protocole de stimulation spécifique ( c.-à-d. Formation).
Ce protocole démontre comment cultiver les cellules neuronales sur les AME, enregistrer avec succès sur plus de 95% des plats plaqués, établir un protocole pour former les réseaux pour répondre aux modèles de stimulation, trier l'activité à une unité, tracer des histogrammes et interpréter les résultats de De telles expériences. L'utilisation d'un système exclusif (voir la Table des matières ) pour la stimulation et l'enregistrement des cultures neuronales est démontrée, ainsi que l'application de logiciels (voir la Table des matériaux ) pour trier les unités neuronales . Une interface utilisateur graphique personnalisée (voir la table des matières ) sert à visualiser les post-sLes histogrammes de temps timulus, les intervalles inter-éclatement et la durée de l'éclatement, ainsi que pour comparer la réponse cellulaire à la stimulation avant et après un protocole de formation.
Protocol
Toutes les procédures animales suivent les lignes directrices du NIH et / ou la Politique sur les services de santé publique sur les soins personnels et l'utilisation des animaux de laboratoire et sont soumises à un protocole de soins et d'utilisation des animaux approuvés par l'institution (IACUC) à l'Université George Mason.
1. Préparation du matériel
- Autoclave les matériaux suivants: pipettes en verre de 5,75 pouces de long disposées verticalement dans (2) 500 ml de béchers, environ 24 morceaux de papier filtre (150 mm de diamètre, chacun coupé en 8 coins, la taille des pores n'a pas d'importance), 1000 μL de pipette filtrée Des pointes, des pointes de pipette filtrées de 200 μl, des pointes de pipette filtrées de 10 μL et de l'eau désionisée (DI) pour les lavages (au moins 200 ml).
- Préparez les réactifs et les supports.
- Préparez tous les réactifs et les milieux dans la bioéthique en utilisant des techniques aseptiques.
- Préparez la poly-D-lysine (PDL) selon le tableau 1 .
- Mélanger le PDL avec de l'eau DI stérile à un c finalOncentration de 50 μg / mL, comme suit. Utilisez une pipette sérologique stérile pour transférer 96 ml d'eau DI stérile dans une bouteille de réactif en verre autoclavé.
- Utilisez une pipette sérologique stérile pour ajouter 4 ml d'eau DI stérile au flacon du fabricant contenant PDL. Dissoudre le PDL en pipettant. Utilisez la même pipette pour transférer la solution de PDL dans la bouteille de réactif en verre contenant 96 ml d'eau DI stérile.
- Tirez fermement la bouteille avant de la retirer de la biotialité et de vortex la solution. Dans la biotialité, divisez la solution en portions aliquotes de 5 ml; Geler toute solution inutilisée à -20 ° C. Le PDL décongelé peut être réarrangé une fois. Jeter la solution décongelée si elle est ré-congelée avant.
- Préparez la solution de laminine selon le tableau 2 .
- Mélanger la laminine avec du PBS jusqu'à une concentration finale de 20 μg / mL, comme suit. Utilisez une pipette sérologique stérile pour transférer 49 mL de PBS dans un tube centrifuge de 50 mL.
- Utilisez une sérologique stérileL pour ajouter 1 mL de PBS au flacon du fabricant contenant le poids approprié de la laminine. Dissoudre la laminine par pipettage. Utilisez la même pipette pour transférer la solution de laminine au tube de centrifugation de 50 ml contenant les 49 ml de PBS.
- Tirez fermement le tube avant de le retirer de la bioité et vortexe la solution. Dans la biotialité, divisez la solution en portions aliquotes de 5 ml; Geler toute solution inutilisée à -20 ° C. La laminine décongelée ne peut pas être surgelée; Jeter toute solution décongelée inutilisée.
- Préparer le support de stockage, selon le tableau 3 .
REMARQUE: Le support de stockage est utilisé pour stocker des tissus jusqu'à un mois à des niveaux ambiants de CO 2 . Il peut être acheté (voir la table des matières), ou il peut être préparé en utilisant la recette générale de: milieu de stockage cellulaire CO 2 ambiant + 2% de supplément de sérum pour la culture de cellules neurales + 0,5 mM de milieu de culture cellulaire qui contient une stabilisation Forme de L-glutamine (voir la table des matières).- Pour fabriquer 10 mL de milieu de stockage, transférer 10 mL de milieu de stockage pour le tissu embryonnaire sans CaCl 2 à un tube centrifuge de 15 mL. Ajouter 210 μL de supplément de sérum pour la culture de cellules neurales et 55 μL d'une forme stabilisée de L-glutamine. Mélanger doucement par inversion.
- Étant donné que le support de stockage est sensible à la lumière, protégez-le en recouvrant les tubes de centrifugation de 15 ml avec du papier d'aluminium. Aliquoter 2 ml de milieu de stockage par tube pour un total de 5 portions aliquotes. Conservez au réfrigérateur pendant 2 semaines ou jusqu'à ce que ce soit prêt à l'emploi, mais ne pas congeler.
- Préparer le DMEM 5/5 en moyenne selon le tableau 4 .
- Décongeler des aliquotes de supplément sans sérum pour la culture de cellules neurales, le sérum de cheval (HS), le sérum bovin fœtal (FBS) et l'acide ascorbique. Décongeler une partie de streptocoque, si nécessaire, pour contrôler la contamination bactérienne. Pipettez chaque ingrédient dans un tube de centrifugation de 50 ml. Assurez-vous que les pointes de pipette ne touchent pas les surfaces ou les objectifsTs.
- À l'intérieur de la biotialité, reliez le filtre au tube à vide avec le vide encore éteint. Verser le mélange dans le dessus du filtre et le fermer. Activez le vide dans la bioité et laissez le filtre moyen au fond du récipient. Débranchez le filtre du vide avant de mettre l'aspirateur hors tension.
- Serrez le couvercle sur le récipient du milieu stérile, étiquetez-le et rangez le milieu non utilisé à 4 ° C pendant un maximum d'un mois. Ouvrez le récipient à l'intérieur de la bioité pour garder le milieu stérile.
- Préparer le DMEM + moyen, selon le tableau 5 .
- Décongeler des aliquotes de supplément de sérum pour la culture de cellules neurales et l'acide ascorbique (et le streptocoque, si nécessaire). Pipettez chaque ingrédient dans un tube de centrifugation de 50 ml. Répétez les étapes 1.2.5.2-1.2.5.3 pour le processus restant.
2. Préparation des tableaux / plat
REMARQUE: Les MEA utilisés dans la procédure sont des réseaux de 60 canaux oRganisé dans un carré de 8 x 8. La distance interélectrode est de 200 μm et chaque électrode mesure 10 μm de diamètre. Le matériau conducteur pour les pistes est en titane et les électrodes elles-mêmes sont en TiN. La bague en verre autour des électrodes mesure 6 mm de haut, avec un diamètre extérieur de 24 mm. Un capuchon en polyoxyméthylène (POM) est utilisé pour couvrir le MEA, et un film d'éthylène propylène fluoré perméable aux gaz / imperméable aux liquides (FEP) est utilisé pour empêcher la contamination pendant les sessions d'enregistrement et de stimulation.
- La veille du placage.
- Faire des MEA inutilisés hydrophiles en les exposant au plasma; Ce n'est généralement pas nécessaire après la première utilisation. Assurez-vous que les lamelles en verre utilisées pour les cultures de contrôle reçoivent également un traitement au plasma.
REMARQUE: Des boîtes en Petri en plastique (35 mm) peuvent également être utilisées comme plats témoins et n'ont pas besoin de prétraitement.- Administrer le traitement au plasma à l'aide d'un filtre à plasma pour 40-60 s à mi-puissance (50 W), wiLa pression de la chambre est réglée à 100-150 mT.
- Remplissez immédiatement les MEA avec de l'eau DI. Immergez les lamelles dans une boîte de Petri remplie d'eau DI. Laissez l'eau DI en contact avec les surfaces traitées pendant environ 15 minutes.
- À l'intérieur de la bioité, aspirer l'eau DI. Remplissez les MEA sur la jante avec 70% d'éthanol. Retirez l'eau DI de la boîte de Petri contenant les lamelles et remplissez la boîte de Petri avec de l'éthanol jusqu'à ce que les lamelles soient complètement immergées. Laissez reposer pendant 10 à 15 minutes.
- Étiquetez toutes les boîtes de Petri et réglez la vaisselle avec le numéro d'identification MEA, la date de la chirurgie, le type de cellule et les initiales. Ensuite, placez chaque MEA dans sa boîte de Petri marquée.
- Placez les MEA dans des boîtes de Petri individuelles et enlevez l'éthanol à l'aide d'une aspiration sous vide. Remplissez les MEA avec de l'eau DI stérile pour enlever l'éthanol résiduel. Utiliser une aspiration sous vide pour enlever l'eau DI. Laissez les AMA sécher à l'air dans la bio-vie.
- Ajouter 40-70 μL de 50 μg / mL de poly-D-lysineE (PDL, poids moléculaire élevé, au moins 50 kDa) au centre de chaque MEA et 0,2 mL pour les contrôles à l'aide de pointes de pipettes stériles.
REMARQUE: Assurez-vous de ne pas toucher le centre du MEA avec la pointe de la pipette car cela pourrait endommager les électrodes. La quantité exacte de PDL dispensée dépend de l'hydrophilie de la surface. - Placez un petit morceau de papier de soie de laboratoire dans chaque plat et humectez-le avec de l'eau stérile pour éviter l'évaporation PDL pendant la nuit. Couvrez tous les plats avant de les retirer de la bio-vie. Placer la vaisselle dans un incubateur à 37 ° C pendant la nuit.
- Faire des MEA inutilisés hydrophiles en les exposant au plasma; Ce n'est généralement pas nécessaire après la première utilisation. Assurez-vous que les lamelles en verre utilisées pour les cultures de contrôle reçoivent également un traitement au plasma.
- Journée de plaquage.
- Au cours du jour du décapage, décongeler 1 aliquote de laminine (20 μg / mL); Chaque MEA nécessite 40-50 μL de laminine, et chaque plat de contrôle nécessite 0,2 ml de laminine. Calculez le volume de laminine nécessaire en fonction du nombre de MEA et de contrôles à utiliser.
- Transférer tous les plats de l'incubateur à la bio-vie.
- Remplissez tous les MEA stérilesDI en utilisant une pipette sérologique stérile et leur permettre de rester assis pendant 10 à 15 min. Aspirez l'eau DI en utilisant des pipettes Pasteur stériles et répétez la procédure deux fois.
- Ajouter 40 à 50 μL de laminine décongelée au centre de chaque MEA et 0,2 ml de laminine aux plaques de contrôle en utilisant des pointes de pipettes stériles. Couvrez tous les MEA et les plats de contrôle dans la bioité et transférez-les à un incubateur à 37 ° C pendant 1 h.
- Retirez avec précaution l'excès de laminine du centre des MEA en utilisant des pipettes Pasteur stériles et laissez la surface sécher à l'air avant le placage.
- Laisser la vaisselle dans la bioité, ou les placer dans un incubateur jusqu'à ce qu'ils soient prêts à plaquer les cellules.
REMARQUE: les plats peuvent rester dans l'incubateur jusqu'au lendemain. Cependant, si vous avez besoin de plus de temps, il est conseillé de nettoyer la vaisselle et de recommencer à partir de l'étape de poly-D-lysine (PDL) (étape 2.1.6).
3. Enlèvement des embryons et cerveauExtraction
- Verser le L-15 (Leibovitz) dans 4 plaques de Petri de 100 mm. Couvrez-les et placez-les dans un congélateur de -20 ° C jusqu'à ce que le milieu ait une consistance lâche mais ne soit pas congelé (~ 40-60 min).
- Faites ceci environ 40 min à 1 h avant la dissection.
REMARQUE: Cela refroidira les embryons et les cerveaux rapidement, de sorte qu'ils ont une consistance ferme et ne se désintègrent pas lors de l'extraction. - Préparez la zone de dissection pour l'élimination des embryons.
- Placez un plateau avec de la glace près d'un évier et déposez les instruments chirurgicaux et les matériaux pour l'élimination des embryons. Il s'agit notamment de 4 boîtes de pétri avec du L-15 "slush" froid, des serviettes en papier, une bouteille avec 70% d'éthanol, des pinces à poux à bout cassé, des pinces fines, de petits ciseaux chirurgicaux et de gros ciseaux ( figure 1 ).
- Préparez la zone de dissection pour l'extraction du cerveau.
- Placez un plat en verre de PetriDans un plateau rempli de glace.
- Disposer les instruments chirurgicaux et les matériaux pour l'extraction du cerveau, y compris les serviettes en papier, les petits ciseaux chirurgicaux, une spatule mince à double extrémité, un vaporisateur rempli de 70% d'éthanol et un sac en plastique pour l'élimination de la carcasse ( figure 2 ).
- Mettez une blouse de laboratoire, une masque et des gants. Pulvériser toutes les surfaces de travail, y compris les gants, avec 70% d'éthanol.
REMARQUE: Bien qu'il ne s'agisse pas d'une procédure stérile, il est préférable de réduire autant que possible les risques de contamination. - Éuthaniser une souris E17 chronométrée selon les directives du NIH 16 et / ou la Politique sur les services de santé publique sur les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire et dans le cadre d'un protocole d'utilisation et d'utilisation des animaux approuvés par l'institution (IACUC) pour l'asphyxie au CO 2 . Assurez-vous de libérer lentement le gaz de CO 2 dans la chambre pendant une période de 3 à 5 minutes afin d'éviter de provoquer la panique ou la discoMlle à la souris.
- Décapitez la souris et placez-la sur une serviette en papier, côté ventrale vers le haut. Pulvériser son bas ventre avec 70% d'éthanol. En utilisant les petits ciseaux chirurgicaux, faites une coupe en V à travers la peau et la graisse sous-cutanée du bas-ventre, en prolongeant la coupe jusqu'aux extrémités distales de la cavité thoracique et en exposant l'utérus.
- En utilisant une pince, soulevez soigneusement l'utérus entre les embryons. Couper le tissu conjonctif avec des ciseaux de dissection jusqu'à ce que l'utérus entier soit libre. Rincez brièvement l'utérus avec de l'éthanol à 70% pour enlever tout le sang et placez-le dans l'une des 4 boîtes de Petri remplies de L-15 froid.
- Relâchez chaque embryon de l'utérus et du sac embryonnaire intérieur à l'aide d'une pince à pointe fine. Assurez-vous que le cordon ombilical a été coupé et que le sac placentaire a été enlevé. Placez les embryons libres dans le deuxième plat rempli de L-15 froid. Décapiter les embryons avec des pinces et des ciseaux. En utilisant une pince, transférez les têtes vers une troisième boîte de Petri et les corpsÀ un quatrième, tous deux pleins de L-15 froid.
4. Enlèvement du cortex frontal
- Dans une bio-vie, placez un coin de papier filtre autoclavé sur le plateau de pétri en verre glacé. Placez une seule tête d'embryon sur le papier filtre. Serrez le crâne en plaçant une pince à travers les cavités oculaires avec la main non dominante. Enlevez la peau et le tissu musculaire sous-jacent avec une paire de ciseaux d'iris.
- Placez le bord tranchant du ciseau inférieur des ciseaux d'iris dans la base du crâne. Garder le plus bas contre la surface intérieure du crâne, loin du cerveau, couper la plaque occipitale puis le long de la ligne médiane entre les plaques pariétal. Continuez à couper en rostrale, entre les plaques de crâne frontal cartilagineuses.
- En commençant au centre de la plaque occipitale, faites une coupe perpendiculaire à gauche et à droite de la coupe centrale.
- Retirer le cerveau en glissant soigneusement une petite spatule entre la surface ventraleDu cerveau et des plaques inférieures jusqu'à ce qu'il soit complètement sous le cerveau. Soulever la spatule vers le haut; Tout le cerveau sortira intact.
- Placez quelques gouttes de milieu L-15 sur le papier filtre afin que le cerveau ne colle pas au papier et glisse doucement le cerveau de la spatule sur le papier filtre, côté ventral vers le bas. Coupez soigneusement l'ampoule olfactive avec la pointe de la spatule.
- En utilisant une spatule propre, disséquer le lobe frontal dans un motif trapézoïdal. Transférer le tissu dans un tube centrifuge de 15 mL contenant un milieu de stockage. Répétez ce qui précède avec les embryons restants. Assurez-vous d'utiliser un nouveau coin de papier filtre à chaque fois ( c.-à-d. Un coin de papier filtre par tête).
5. Dissociation cellulaire
- Dans la biotialité, assemblez les éléments énumérés au tableau 6 .
- Utiliser une pipette sérologique stérile pour ajouter 5 mL de DMEM + à un flacon de papaïne; Le DMEM + réchauffé peut être utilisé pour mieux dissoudre la papaïne. DoucementPipette pour mélanger la solution.
- Utilisez une micropipette stérile pour ajouter 0,5 mL de DMEM + à un flacon de DNase. Évitez le pipetage énergique lors de la fabrication de la solution DNase, car la DNase est sensible à la dénaturation par cisaillement.
- Transférer 2,5 ml de solution de papaïne dans un tube centrifuge stérile et ajouter 125 μL de DNase au même tube. Mélanger la solution en inversant doucement le tube de centrifugation coiffé environ 8 fois.
- À l'aide d'une pipette stérile à large diamètre, retirez les tissus du tube contenant le milieu de stockage et placez-le dans une boîte de Petri stérile de 35 mm. Recueille le plus petit possible possible. Utilisez une pipette stérile pour enlever autant que possible le milieu de stockage excédentaire sans enlever le tissu. Le tissu ne devrait pas flotter en milieu, mais il devrait être humide.
- Utilisez deux lames de scalpel stériles pour hacher le tissu. Utilisez une pipette sérologique stérile pour ajouter 2,5 mL du mélange de DNase / Papainle au tissu émincé dans la boîte de Petri. Tournez doucement la boîte de Petri pour vous assurerTous les tissus sont libres dans la solution et ne sont pas collés au fond du plat. Placer le plat dans un incubateur à 37 ° C pendant 15 min.
- Dans la bio-vie, utilisez une pipette de transfert stérile à large diamètre pour transférer tous les milieux et tous les tissus dans un tube cryogénique stérile de 5 mL. Placez la pointe de la même pipette de transfert à large diamètre près du fond du tube. Triturer doucement en pipetant lentement jusqu'à 10-15 fois.
- Évitez de former des bulles pendant le pipetage. Répétez le processus en utilisant une pipette de transfert à faible diamètre jusqu'à obtention d'un mélange homogène. Si le tissu n'est pas dissocié, triturer à l'aide d'une pipette de 1000 μl.
- Ajouter 2 ml de DMEM 5/5 chauffé au mélange cellulaire dissocié. Tirez le tube de la centrifugeuse tout en restant dans la bio-vie. Mélangez doucement par inversion. Centrifuger environ 573 xg pendant 5 min à température ambiante (20-25 ° C).
- Dans la bio-vie, utilisez une pipette sérologique stérile pour éliminer et jeter tout le surnageant, sans casser lepastille. Utilisez une pipette stérile pour ajouter 1 ml de DMEM 5/5 chauffé à la pastille dans le tube pour ré-suspendre les cellules. Utilisez une pipette de transfert stérile à petit diamètre pour décomposer la pastille en faisant pipeter doucement et vers le haut jusqu'à ce que le mélange soit homogène.
REMARQUE: Évitez de former des bulles pendant le pipetage. Si très peu de tissu a été recueilli, n'ajoutez que 0,5 mL de DMEM 5/5. - À l'intérieur de la bio-vie, utiliser une pipette stérile pour transférer 10 μL de la suspension cellulaire dans un tube à microcentrifugeuse. En dehors de la biotialité, ajouter 10 μL de bleu trypan aux 10 μl de suspension cellulaire dans le tube microcentrifugeuse.
REMARQUE: cette étape ne nécessite pas de stérilité. - Chargez 10 μL de la suspension de cellule bleue Trypan dans une puce d'hémocytomètre jetable afin de compter les cellules.
6. Plaquage des cellules
- Dans la bio-vie, utilisez une micropipette stérile pour transférer 50 μL de suspension de cellules au centre de chaque matrice et chaque boîte de Petri témoin. Utilisez un piPette Tip par plat. Assurez-vous de mettre les cellules exactement au centre du tableau. Re-mouiller le papier de soie de laboratoire qui était dans le plat avec de l'eau stérile, ou placer de nouveau du papier de soie dans chaque plat. Couvrez la vaisselle.
- Placez les boîtes de Petri couvertes dans un incubateur réglé à 37 ° C et 10% de CO 2 pendant 3-4 h.
- Dans la biotialité, ajouter doucement 1 mL de DMEM 5/5 réchauffé à chaque MEA.
REMARQUE: Évitez de nettoyer les cellules du réseau central lorsque vous ajoutez le support (important!). Très soigneusement, utilisez une micropipette stérile pour ajouter une goutte à la fois autour des bords intérieurs. - Placez un capuchon contenant une membrane FEP perméable aux gaz sur chaque MEA. Retournez-les à l'incubateur pendant deux jours.
REMARQUE: le capuchon empêche la contamination et l'évaporation. Suivez la technique aseptique, séchez les capsules dans la bioity avec 100% d'éthanol avant de les mettre sur le MEA. Les cultures doivent être plafonnées dans la bio-vie et doivent rester plafonnées en tout temps.
7. PrincipalTaining the Cultures
- Après deux jours, effectuez un remplacement moyen complet par DMEM + réchauffé.
- Transférer seulement quelques plats de l'incubateur à la bio-vie à la fois pour éviter de stresser trop longtemps les cultures.
- Utilisez une micropipette stérile de 1 ml pour extraire tout le milieu du plat en plaçant soigneusement le bout de la pipette sur la paroi intérieure du plat, en évitant de toucher les cellules au centre. N'utiliser qu'une pointe de pipette par plat pour éviter la propagation de la contamination.
- Utilisez une micropipette stérile pour distribuer 1 mL de DMEM + chaud, en plaçant soigneusement le bout de la pipette sur la paroi intérieure du plat.
- Effectuer des changements moyens de 50% avec le DMEM + réchauffé, tel que décrit ci-dessus, 2 à 3 fois par semaine et au plus 4 jours entre les repas.
- Utilisez une micropipette stérile de 1 mL pour extraire 500 μL de milieu du plat. Utilisez une micropipette stérile pour distribuer 500 μL de DMEM + chaud. </ Li>
8. Inspections visuelles et enregistrement
- Inspectez les échantillons de plat tous les deux jours sous un microscope pour rechercher une couverture cellulaire sur le tableau (en utilisant un grossissement 4X et 10X) et une contamination (en utilisant un grossissement 20X), soit bactérienne, soit fongique.
NOTE: La figure 3a montre un exemple de couverture cellulaire optimale, alors que la figure 3b montre une culture à densité de cellules médiocres. - Deux semaines après le placage, testez un échantillon de plats MEA pour une activité spontanée. Enregistrement des MEA, comme décrit ci-dessous, pour 3-5 min. Les pointes seront détectées si l'activité est présente ( Figure 4 ).
REMARQUE: il appartient à l'expérimentateur de déterminer quand commencer le test en fonction du type d'expérience et de l'hypothèse étudiée.- Pour enregistrer l'activité dans un MEA, utilisez les équipements suivants: alimentation, amplificateur, tête de tête / préamplificateur, Contrôleur de température et générateur de stimulation (voir la table des matériaux et la figure 5 ).
- Avant de retirer les cultures de l'incubateur, branchez le régulateur de température et allumez le système en allumant l'alimentation (selon les instructions du fabricant), ce qui permet à la plaque de base chauffée du préamplificateur d'atteindre 35 ° C.
- Placez la culture tamisée dans le préamplificateur de sorte que la ligne noire du MEA soit bien alignée avec le sol de référence. Assurez-vous que les broches du préamplificateur s'alignent, que le haut du préamplificateur est sécurisé et que le capuchon de culture est toujours allumé.
- Une fois que la culture est placée dans la plaque, décochez l'option "Change MEA" sur le logiciel d'acquisition de données (voir la table des matières pour les noms de logiciels et les guides d'utilisation). En outre, décochez la case "Blanking" avant de faire des enregistrements.
- Sélectionnez "Télécharger" dans "MEA_Select" après tLa culture est placée dans le système. Vérifiez que le programme affiche "Télécharger OK" avant de continuer.
- Appuyez sur "Démarrer" dans l'environnement logiciel pour commencer à visualiser les signaux. Dans la fenêtre principale, sélectionnez: "Spikes" → "Détection" → "Automatique", modifiez la valeur "Std Dev" sur "5", puis cliquez sur "actualiser" pour réinitialiser le seuil.
REMARQUE: La fenêtre "Spikes" affiche des pointes dépassant le seuil. - Dans la fenêtre principale, sélectionnez "Enregistreur" → "Enregistreur" → "Parcourir". Modifiez le chemin d'accès et le nom du fichier pour identifier la date, l'heure, le plat et l'expérience. Réglez le délai ( par exemple, jusqu'à 5 min). Cliquez sur "Arrêter", "Enregistrer" et "Jouer". Notez que l'enregistrement s'arrête automatiquement.
- Ouvrez le logiciel de stimulation. Sélectionnez "Enregistreur" → "Enregistreur" → "Parcourir" pour créer un fichier et définir le timE limite. Cliquez sur "Arrêter", "Enregistrer" et "Lire" pour enregistrer à nouveau. Cliquez sur "Télécharger et démarrer" (sur le logiciel de stimulation) pour que la stimulation soit livrée au plat.
- Sélectionnez le bouton "Change MEA" dans la commande du logiciel pour changer de vaisselle.
REMARQUE: Ne retirez pas la culture de l'incubateur pendant plus de 30 minutes à la fois sans système pour maintenir une atmosphère de CO 2 autour de la culture. Si des sessions d'enregistrement plus longues sont nécessaires, utilisez un adaptateur disponible dans le commerce pour fournir du CO 2 .
9. Réseaux de formation
NOTE: La figure 6 montre un aperçu des étapes 9.1 à 9.3, décrites ci-dessous.
- Enregistrez une ligne de base de 5 minutes d'activité spontanée à partir de la culture cellulaire (comme décrit à l'étape 8). Une fois que la ligne de base a été établie, administrer une stimulation de sondage de pré-formation de 5 minutes consistant en un biphasique de 0,5 HzImpulsion avec une durée d'impulsion de 200 μs et une amplitude d'impulsion de 900 mV ( Figure 7a ) à travers les électrodes de stimulation sélectionnées, comme le montre la Figure 8 (voir le manuel du logiciel dans la table des matériaux pour plus de détails sur la sélection des électrodes de stimulation).
- Après avoir terminé la stimulation de pré-formation, administrez un protocole de "formation" aux réseaux en utilisant les mêmes électrodes que dans la stimulation de sondage. Livrez les trains haute fréquence tous les 2 s, comme décrit dans Hamilton et al. 15 ( Figure 7b et Figure 7c ).
REMARQUE: Le signal de formation comprend 40 trains d'impulsions. Chaque train d'impulsions est composé de 100 impulsions biphasiques, avec 4 ms entre les impulsions, une durée d'impulsion de 200 μs et une amplitude de l'impulsion de 900 mV. - Après avoir terminé la période de formation, administrer une stimulation post-formation de 5 minutes aux cellules,Identique à la stimulation pré-formation. Une fois la stimulation post-formation terminée, enregistrer 5 min de l'activité spontanée post-stimulation du réseau (comme décrit à l'étape 8).
- Utilisez un groupe de contrôle distinct des MEA pour tenir compte des changements possibles dans la réponse du réseau en raison de fluctuations naturelles ou de non-stationnariat du système. Administrer le même protocole expérimental décrit ci-dessus à ces groupes témoins, à l'exception que les groupes témoins reçoivent une période de formation simulée dans laquelle aucun signal de formation réel n'est administré.
10. Analyse des données
Remarque: Les fichiers de données sont enregistrés et ensuite triés en unités neuronales à l'aide d'un logiciel de tri propriétaire (voir la table des matières). Une interface utilisateur graphique personnalisée (GUI) est utilisée pour charger les unités et analyser les profils d'activité dans les cultures, les intervalles inter-éclatement, la durée de l'éclatement et l'histogramme temporel post-stimulus (PSTH) (voir la table des matériaux). Le PSTH estLe graphe le plus important à analyser, car il affiche l'activité du réseau en taille de bac (de longueur variable), fournissant ainsi une représentation visuelle de la réponse du réseau à la stimulation présentée.
- Convertissez les fichiers de données .mcd en format .plx à l'aide d'un logiciel de tri propriétaire (voir la table des matières pour les noms de logiciels et les guides d'utilisation). Exportez le fichier .plx à un nouveau fichier .plx dans le même programme. Trier les canaux en unités neuronales ( Figure 9 ). Une fois le tri terminé, exportez les données sous la forme d'un fichier .nex.
- Ouvrez le fichier .nex dans le logiciel approprié (voir la table des matériaux ) et enregistrez-le en tant que fichier .mat à analyser avec l'interface graphique personnalisée, disponible gratuitement (voir la table des matériaux ).
REMARQUE: L'interface utilisateur graphique (voir la table des matériaux) trace des PSTH selon l'entrée de l'utilisateur ( c.-à-d. PSTH de la population, PSTH moyenne pondérée ou canal P individuelSTH), permettant un aperçu de l'expérience de stimulation et une comparaison immédiate entre les fichiers post-pré-stimulus. Il représente également les PSTH initiales versus finales, ce qui compare la réponse du réseau aux 6 premiers et aux 6 derniers stimuli. L'interface graphique exécute plusieurs autres fonctions, telles que le taux de pointage, l'intervalle inter-spike, les pointes par éclatement, l'intervalle inter-éclatement et la durée de l'éclatement, tant pour les fichiers de stimulation que pour les fichiers à activité spontanée. - Tout d'abord, sélectionnez un fichier .mat avec des variables contenant des trains de pointe et une variable contenant l'artefact de stimulation; Le script analysera les données et l'interface graphique principale apparaîtra avec un graphique moyen PSTH à droite ( Figure 10 ).
- Cliquez sur les boutons actifs de l'électrode pour voir le PSTH individuel (en bleu) par rapport à la PSTH moyenne (en rouge).
REMARQUE: Les électrodes actives seront colorées pour montrer une carte de chaleur, où des valeurs plus élevées (plus rouges) représentent plus grandeValeurs maximales de PSTH, indiquant une réponse plus forte à la stimulation. - Sélectionnez une option d'analyse à l'aide du menu contextuel. Sélectionnez le bouton "Moyenne biaisée" pour sélectionner un sous-ensemble d'électrodes et tracer la moyenne de ce sous-ensemble; Ceci est utile pour comparer le comportement des sous-réseaux au sein d'une culture.
REMARQUE: il existe plusieurs options d'analyse différentes sélectionnées dans le menu contextuel, et elles sont toutes expliquées dans le bouton «Aide» du logiciel. - Sélectionnez le bouton "Enregistrer le graphique" pour enregistrer le graphique actuellement affiché en tant que fichier jpeg à haute résolution. Sélectionnez le bouton "Tableau de données" pour exporter les données dans une feuille de calcul.
- Cliquez sur les boutons actifs de l'électrode pour voir le PSTH individuel (en bleu) par rapport à la PSTH moyenne (en rouge).
Representative Results
En utilisant la procédure présentée ici ( Figure 11 ) , des MEA à 60 canaux plaqués avec des cellules neuronales de souris E17 ont été incubés jusqu'à ce que les cultures couvrent les réseaux dans un tapis sain de cellules ( Figure 12 et Figure 3a ) . Après 3 semaines d'incubation à 10% de CO 2 et 37 ° C, les cultures ont été vérifiées pour une activité spontanée en utilisant un système d'enregistrement commercial (voir la Table des matériaux ). La température a été maintenue à 37 ° C pendant la procédure d'enregistrement en utilisant un régulateur de température, puisque la température affecte l'activité neuronale et les taux de tir.
Test d'activité
Les réseaux spontanément actifs présentent normalement des motifs de signaux variables. Une culture active moyenne peut enregistrer une activité dans unEnviron 40% des électrodes. De ces sites d'électrodes actives, près de la moitié enregistrent des signaux spontanés, avec des taux de tir allant de 5 à 10 Hz. Un graphique représentatif de l'activité spontanée est représenté à la figure 4a . Les marques de repère indiquent les horodatages des potentiels d'action enregistrés sur 9 électrodes actives pendant une fenêtre de 20 s, à une vitesse d'acquisition de 25 kHz et une plage de filtre passe-bande entre 300 Hz et 3 kHz. La figure 4b montre le bruit de base et le signal extracellulaire brut filtré pendant 8 rafales d'activité avant la procédure de tri. Pour séparer les potentiels d'action du bruit, les seuils pour chaque canal sont définis à 5 fois l'écart type du bruit de ligne de base et sont calculés sur une fenêtre de 500 ms 15 .
Avant l'analyse, les pointes enregistrées pour chaque électrode ont été classées en mode hors connexion pour distinguer physioL'activité logique et les artefacts de stimulation en utilisant un algorithme k-means et une analyse de composants de principe. Les signaux qui ont été identifiés comme des réponses physiologiques ont été regroupés pour créer une réponse de population à chaque électrode ( Figure 13 et Figure 9 ) 15 .
Formation de réseaux de neurones avec stimulation électrique
Les réseaux ont été formés en utilisant la stimulation électrique appliquée à la culture directement à travers les électrodes MEA à l'aide d'un générateur de stimulus (voir la table des matériaux). Dans cet ensemble de résultats représentatifs, une configuration "L" composée de 13 électrodes a été utilisée ( Figure 8 ), bien que beaucoup d'autres configurations puissent être appliquées. La stimulation de sondage et d'entraînement était basée sur des paramètres définis dans Ruaro et al. 14 .
Une ligne de base a été initialement établie en enregistrant 5 minutes d'activité spontanée avant la stimulation. Une fois que la ligne de base a été établie, une stimulation de sondage de pré-formation de 5 minutes consistant en une impulsion biphasique de 0,5 Hz avec une durée d'impulsion de 200 μs et une amplitude de pouls de 900 mV ( Figure 7a ) a été administrée à travers les sites de stimulation sélectionnés ( c.-à-d. "L" -en forme de). Un protocole de formation a ensuite été administré aux réseaux tous les 2 s en utilisant le même ensemble d'électrodes. Le signal de formation était composé de 40 trains d'impulsions, contenant chacun 100 impulsions biphasiques, avec une période d'interopération de 4 ms, une durée d'impulsion de 200 μs et une amplitude de pouls de 900 mV ( Figure 7b et Figure 7c ). Cette période de formation a ensuite été suivie d'une phase post-formation de 5 min, similaire à la stimulation pré-entraînement. Le protocole était alorsA conclu avec un enregistrement 5 minutes de l'activité spontanée post-stimulation.
Le même protocole expérimental a été appliqué à un groupe témoin de cultures pour tenir compte des fluctuations naturelles de la réponse du réseau. La seule différence dans le protocole de contrôle, cependant, était l'application d'une période de formation simulée, au cours de laquelle aucun signal de formation réel n'a été administré.
Les analyses statistiques des ensembles de données ( c.-à-d. La formation par rapport au contrôle) ont été réalisées avec une ANOVA à sens unique, avec la variable «formation» en tant que facteur intermédiaire. La latence a été utilisée comme un facteur interne. Si une interaction significative a été trouvée, la procédure post-hoc de Tukey a été effectuée. Les résultats ont montré une réponse de pré-formation dans les 20 ms post-stimulus, bien que la gamme d'activité était incohérente après la première réponse. Toutefois, l'activité de post-formation a présenté non seulement Une réponse dans les 20 premiers post-stimulus, comme on l'a vu lors de la pré-formation, mais il a également montré une activité significative de 30 à 50 ms post-stimulus ( Figure 14 et Figure 15 ) 15 . Il y avait aussi une corrélation statistiquement significative de la «fréquence de pointe» par rapport au «temps après le stimulus» et de la «fiabilité de la pointe» par rapport au «temps après le stimulus». La "fiabilité de Spike" peut être définie comme la probabilité de voir une réponse du réseau à une stimulation, où une réponse à chaque stimulus est attribuée à une valeur maximale de 1. La figure 16 montre une augmentation de 50% de la fréquence de pointe, ainsi qu'une 30 -50% d'augmentation de la fiabilité des pointes pour les réseaux qualifiés par rapport au contrôle dans la gamme de 20 à 50 ms post-stimulus. Ces résultats suggèrent que la formation a fondamentalement changé la dynamique du réseau.
1 "class =" xfigimg "src =" / files / ftp_upload / 55726 / 55726fig1.jpg "/>
Figure 1 : Outils et matériaux utilisés pour l'élimination des embryons. ( A ) Plateau rempli de glace. ( B ) Plats de pétri remplis de L-15 "froid". ( C ) Serviette en papier. ( D ) Bouteille de pulvérisation avec 70% d'éthanol. ( E ) Pince fine (x2). ( F ) Petits ciseaux chirurgicaux. ( G ) Pince à pouce à pointe noire. ( H ) Gros ciseaux. ( I ) Sac de corps. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Outils et matériaux utilisés pour l'extraction du cerveau. ( A B ) Boîte de Petri contenant des têtes d'embryons. ( C ) Tube à centrifuger recouvert d'aluminium avec support de stockage. ( D ) Plat de Petri en verre inversé. ( E ) Papier filtre autoclavé. ( F ) Beaker avec 70% d'éthanol. ( G ) Pipette en plastique. ( H ) Ciseaux d'iris. ( I ) Pinces fines. ( J ) Spatule mince à double extrémité. ( K ) Serviette en papier. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Cultures optimales et non optimales. ( A ) montre un tapis sain de cellules couvrant les tableaux, contrairement à ( B ),Dans lequel il existe une prolifération cellulaire médiocre. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Résultats représentatifs de l'activité spontanée. ( A ) Graphique représentatif de l'activité spontanée. Les marques de repère indiquent des potentiels d'action enregistrés à partir de 9 électrodes actives pendant une fenêtre de 20 s à une vitesse d'acquisition de 25 kHz et une plage de filtre passe-bande comprise entre 3 kHz et 300 Hz. ( B ) Potentiel d'action extracellulaire filtré représentatif à partir d'un site actif. Figure modifiée à partir de la référence 15 . Cliquez ici pour voir un plus grand versioN de cette figure.
Figure 5 : Configuration de l'enregistrement. ( A ) Générateur de stimulation. ( B ) Régulateur de température. ( C ) Alimentation électrique. ( D ) Amplificateur. ( E ) Prise de courant / préamplificateur. ( F ) MEA plombé. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6 : Représentation schématique du protocole d'entraînement électrique. Enregistrer une ligne de base initiale pendant 5 minutes et une stimulation de la sonde pendant 3 min. Appliquer la stimulation tétanique Sur 90 s, qui n'est pas enregistré. Appliquer et enregistrer une seconde stimulation de la sonde pendant 3 min et une ligne de base finale pendant 5 min. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 7 : Paramètres du signal de stimulation et de formation de sonde. ( A ) La stimulation de la sonde consiste en des impulsions bi-phasiques de ± 900 mV administrées à une fréquence de 0,5 Hz. ( B ) Les trains d'impulsions sont constitués de 100, ± 900 mV d'impulsions bi-phasiques à une fréquence de 250 Hz. ( C ) Le signal de formation consiste en 40 trains d'impulsions administrés toutes les 2 s. Figure modifiée à partir de la référence 15 ."_blank"> Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 8 : Représentation de la configuration "L". Les carrés représentent des électrodes individuelles d'un MEA. Les carrés bleus indiquent les électrodes utilisées pour la stimulation, tandis que les autres sont utilisés pour l'enregistrement. Figure modifiée à partir de la référence 15 . Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 9 : Unités distinctives des artefacts de bruit et de stimulation. Les différents panneaux supérieurs ( A -
Figure 10 : Histogramme de temps post-stimulus (PSTH). Une interface utilisateur graphique (voir la Table des matériaux ) trace les PSTH en fonction de l'entrée de l'utilisateur ( c.-à-d. La population PSTH, PSTH moyenne pondérée ou individuelleCanal PSTH), permettant un aperçu de l'expérience de stimulation et une comparaison immédiate entre les fichiers post et pré-stimulus. Il représente également les PSTH initiaux versus définitifs; Cela compare la réponse du réseau aux 6 premiers et aux 6 derniers stimuli. L'interface graphique exécute plusieurs autres fonctions, telles que le taux de pointage, l'intervalle inter-spike, les pointes par éclatement, l'intervalle inter-éclatement et la durée de l'éclatement, tant pour les fichiers de stimulation que pour les fichiers à activité spontanée. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 11 : Aperçu de la préparation et du placage des cellules. ( A ) Une souris enceinte E17 est euthanasiée avec du CO 2 . ( B ) La souris est décapitatEd et l'utérus est enlevé. ( C ) Les embryons sont libérés et décapités. ( D ) Le cerveau est extrait de chaque embryon et les lobes frontaux sont éliminés. ( E ) Les cellules sont dissociées. ( F ) Les cellules dissociées sont suspendues dans le milieu. ( G ) Les cellules suspendues sont plaquées sur des réseaux multi-électrodes à 60 canaux (MEA). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 12 : Cultures de neurones plaquées sur des tableaux de microélectrode. Les neurones de souris embryonnaires sont plaqués sur des MEA à 60 canaux, ce qui permet l'enregistrement simultané de l'activité neuronale à travers le réseau à partir de chaque électrode. (Figure modifiéeDe la référence 15 ). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 13 : programme de tri utilisé pour classer les formes d'onde de chaque canal. Le programme de tri (voir la table Matériaux ) charge un fichier de données et affiche toutes les unités initialement acquises pour chaque canal. L'une des nombreuses méthodes est sélectionnée pour attribuer des signaux à des unités spécifiques. Dans cet exemple, l'algorithme de clustering k-means a été sélectionné et l'unité jaune (étiquetée "unité a" dans la fenêtre inférieure) a été identifiée. Un autre programme (voir Tableau des matériaux ) est ensuite utilisé pour exporter le fichier .nex vers un fichier .mat, qui est le fichier d'entrée de l'interface graphique personnalisée (voir
Figure 14 : Activité de réseau modifiée en réponse à la stimulation après une période de formation. Tracé représentatif de l'activité à partir de huit électrodes. La ligne rouge verticale indique l'heure de la stimulation, et les marques noires indiquent des potentiels d'action. En pré-formation ( A ), il y a une réponse immédiate à la impulsion de stimulation à travers les canaux. En post-formation ( B ), le réseau présente une réponse d'activité plus prolongée, ainsi que la réponse immédiate à la stimulation 15 ..jove.com / files / ftp_upload / 55726 / 55726fig14large.jpg "target =" _ blank "> Cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 15 : Les réseaux formés ont des fréquences de pointage significativement modifiées. La fréquence du sping du réseau pour les réseaux de contrôle est calculée en intégrant le nombre de pointes supérieures à 50 ms immédiatement après chaque stimulation et en divisant cette période. On note la moyenne de 12 réseaux formés et 10 de contrôle (les barres d'erreur indiquent l'erreur standard de la moyenne). L'astérisque (*) indique une différence statistique ( valeur p <0,05) entre les deux ensembles de données. Figure modifiée à partir de la référence 15 . Cliquez ici pour voir unDe cette figure.
Figure 16 : Les réponses à médiation syntatique sont significativement modifiées dans les réseaux formés. ( A ) La fiabilité de la pointe, mesurée dans les bacs de 10 ms et normalisée aux réseaux de contrôle, ne montre aucun changement pour l'activation directe des neurones près des électrodes (0 à 20 ms). Il n'y a donc pas de différence statistique entre les contrôles et les réseaux formés pour ces bacs. D'autre part, les réponses à plus long terme (30-50 ms) sont syntaxiquement médiatisées, ce qui indique que cette méthode fournit une étude plus détaillée de la fiabilité que dans la Figure 15 ci-dessus. ( B ) La fréquence de pointe de la population répète le comportement de la fiabilité et ne montre aucune modification pour l'activation directe (0-20 ms), alors qu'une statUne différence significativement significative est trouvée pour les réponses à plus long terme (30 à 50 ms). Ce comportement est conforme aux résultats calculés en moyenne dans la figure 15 ci-dessus . Les barres d'erreur sont l'erreur standard de la moyenne, calculée pour 10 réseaux de contrôle et 12 réseaux formés. (*) P-value <0,05; (**) p-value <0,001. Figure modifiée à partir de la référence 15 . Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Qté | Article |
| 1 | Bouteille de réactif en verre autoclavé (au moins 100 ml de taille) |
| 20 | Tubes centrifuges stériles de 15 ml |
| 1 | 10 mL de pipette sérologique stérile |
| 4 | 25 ml stérilPipette sérologique |
| 2 | 50 mL de pipette sérologique stérile |
| 1 | Porte-tubes centrifuge |
| 150 mL | Eau DI stérile |
| 5 mg | Flacon de Poly-D-lysine |
Tableau 1: Préparation PDL - Liste des matériaux et des réactifs.
| Qté | Article |
| 1 | Tubes centrifuges stériles de 50 ml |
| dix | Tubes centrifuges stériles de 15 ml |
| 2 | 1 mL de pipette sérologique stérile |
| 2 | 50 mL de pipette sérologique stérile |
| 1 | Porte-tubes centrifuge |
| 1 mL | PhosphateTampon salin (PBS) |
| 1 mg | Laminin |
Tableau 2: Préparation de la laminine - Liste des matériaux et des réactifs.
| Qté | Article |
| 1 | Bouteille de réactif en verre autoclavé (au moins 100 ml de taille) |
| 20 | Tubes centrifuges stériles de 15 ml |
| 1 | 10 mL de pipette sérologique stérile |
| 4 | 25 mL de pipette sérologique stérile |
| 2 | 50 mL de pipette sérologique stérile |
| 1 | Porte-tubes centrifuge |
| 150 mL | Eau DI stérile |
| 5 mg | Flacon de Poly-D-lysine |
Tableau 3: Préparation du milieu de stockage - Liste des matériaux et des réactifs.
| Qté | Article |
| 44 mL | DMEM avec une forme stablilisée de L-glutamine (voir table des matières) |
| 1 mL | Supplément sans sérum pour la culture de cellules neurales (voir table des matières) |
| 2,5 mL | Sérum de cheval |
| 100 μL | Acide ascorbique [4 mg / mL] |
| 2,5 mL | Sérum bovin fœtal (FBS) |
| 0,5 mL | Stylo plume (facultatif) |
| 1 | Tubes centrifuges stériles de 50 ml |
| 2 | 25 mL de pipette sérologique stérile |
| 2 | 10 mL de pipette sérologique stérile </ Td> |
| 2 | 1 mL de pipette sérologique stérile |
| 1 | Filtre de 250 ml |
Tableau 4: Préparation moyenne DMEM 5/5 - Liste des matériaux et des réactifs.
| Qté | Article |
| 49 mL | DMEM avec une forme stablilisée de L-glutamine (voir table des matières) |
| 1 mL | Supplément sans sérum pour la culture de cellules neurales (voir table des matières) |
| 100 μL | Acide ascorbique [4 mg / mL] |
| 0,5 mL | Stylo plume (facultatif) |
| 1 | Tubes centrifuges stériles de 50 ml |
| 2 | 25 mL de pipette sérologique stérile |
| 2 | 1 mL de pipette sérologique stérile |
| 1 | Filtre de 250 ml |
Tableau 5: DMEM + Préparation moyenne - Liste des matériaux et des réactifs.
| Qté | Article |
| 1 | Papain 140 U / flacon |
| 1 | Dnase 1 260 U / flacon |
| 7 mL | DMEM + (refroidi) |
| 5 mL | DMEM 5/5 (réchauffé) |
| 10 μL | Bleu trypan |
| 2 | Lames de scalpel |
| 1 | Plat de Petri stérile de 35 mm |
| 4 | Tubes centrifuges stériles de 15 ml |
| 2 | 5 ml de tubes cryogéniques stériles |
| 2 | 2 ml de tubes cryogéniques stériles |
| 1 | Tubes centrifuges stériles de 50 ml |
| 1 | Tube de microcentrifugeuse |
| 2 | Pipette de transfert à gros orifices |
| 3 | Pipette de transfert à petit diamètre |
| 5 | 2 mL de pipette sérologique stérile |
| 5 | 1 mL de pipette sérologique stérile |
| 2 | 10 μL de pointes de micropipettes stériles |
| 1 | 1000 μL de pointes de micropipettes stériles |
| 1 | Hemocytometer chip |
Tableau 6: Dissociation cellulaire - Liste des matériaux et des réactifs.
Discussion
Les étapes décrites dans ce protocole fournissent suffisamment de détails pour que le débutant prenne ses propres cultures neuronales sur les AME et enregistre l'activité du réseau. Ce protocole aidera à s'assurer que les cultures adhèrent correctement, en formant une couche de tapis sur les matrices des électrodes et restent en bonne santé et sans contaminants pendant des mois.
Bien qu'il soit préférable d'adhérer à toutes les parties du protocole, il existe des étapes tout au long du processus qui sont essentielles à la réussite. L'utilisation de la technique aseptique tout au long du processus est impératif pour empêcher les cultures de se contaminer. Les nouveaux MEA doivent être hydrophiles, comme décrit dans le protocole, ou bien une faible adhésion cellulaire résultera. L'évitement des pipettes sévères et la formation de bulles d'air pendant la dissociation réduiront le nombre de cellules endommagées et conduiront à un rendement plus élevé et plus sain. Passer du DMEM 5/5 au DMEM + après le premierL'alimentation est également importante. DMEM 5/5 contient du sérum de cheval, ce qui entraînera des cellules gliales à dominer la culture si elles sont utilisées en continu et entraîneront une activité neuronale médiocre, même si les cultures apparaîtront en bonne santé 17 . L'alimentation des cultures comme prévu et leur maintien dans des conditions d'incubation appropriées est également crucial.
Le plaquage des cultures de cellules sur les AME implique de nombreuses variables qui peuvent conduire à des résultats moins optimistes. Bien que l'objectif soit un "tapis" parfait des cellules, le fait de ne pas aborder les étapes critiques mentionnées ci-dessus entraînera une mauvaise maturation cellulaire ou une contamination. Une mauvaise adhésion cellulaire, qui est différente de la mauvaise maturation cellulaire, est également une préoccupation. Cela peut être causé par plusieurs facteurs, y compris une mauvaise préparation des MEA avant le placage ou l'utilisation d'un ancien milieu. Si un ancien milieu contenant une forme stabilisée de L-glutamine et un complément sans sérum pour la culture de cellules neurales (voir Tableau des matériaux) Est utilisé, les cellules adhèrent initialement mais ensuite flottent après environ deux semaines. Si la contamination bactérienne est un problème persistant, un antibiotique, tel que l'ampicilline ou la streptocoque, peut être ajouté au milieu. Il existe également des fongicides disponibles pour traiter la contamination fongique. Voici quelques-unes des variables les plus communes qui peuvent affecter les résultats des cultures. Il y en a beaucoup d'autres qui ne seront rencontrés qu'après de temps et d'expérience.
Par rapport à l'utilisation de microélectrodes en verre, cette technique est excellente pour étudier la dynamique du réseau et les réponses pharmacologiques. Il permet d'utiliser de nombreux motifs de stimulation spatio-temporels différents et permet l'enregistrement de réponses neuronales à partir de plusieurs zones à la fois. Les groupes précédents ont démontré des résultats intéressants en utilisant des protocoles similaires à ceux décrits ici 18 . Comme les cultures durent des semaines ou des mois et que les mêmes cultures peuvent être réutilisées, cette technique est aussi unePour des expériences multiples au fil du temps sur le même réseau.
Cependant, il existe des limites à cette technique. Les AME ne sont pas invasifs. Par conséquent, ils ne peuvent enregistrer que l'activité extracellulaire, par opposition à un clampage ou un enregistrement intracellulaire avec des pipettes. En outre, comme chaque électrode dans un réseau est couverte par plusieurs cellules, il n'est pas possible de résoudre l'activité d'un seul neurone. À l'inverse, parce que ce sont des cultures in vitro , ils ne peuvent pas reproduire pleinement les propriétés structurelles des réseaux dans le cerveau. En outre, l'activité ne peut être enregistrée que pendant moins de 30 minutes à la fois sans un mécanisme fournissant une atmosphère de CO 2 pour que les cellules maintiennent leur équilibre de pH.
Une fois que cette technique est maîtrisée, des manipulations pharmacologiques avec ou sans stimulation électrique peuvent être explorées. De nouveaux protocoles pour sondage de l'apprentissage et la formation de la mémoire dans les réseaux neuronaux peuvent également être conçus et testés, avec pRotocoles pour les réseaux d'halo-ormea ou de la moelle épinière. Des protocoles pour la stimulation et la formation des réseaux ont été précédemment publiés, et certains d'entre eux ont été développés dans des protocoles in vivo , tels que l'adaptation sélective proposée par Eytan et al. 19 . Plusieurs protocoles ont été testés. Cependant, seuls les résultats d'une modification de la procédure du tétanos proposée par Ruaro en 2005 sont présentés ici 14 , 20 .
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par la subvention de la National Science Foundation CMMI-1300007. Nous souhaitons remercier les anciens membres du laboratoire, qui ont contribué à la conception de ces protocoles et au maintien des cultures depuis plus de cinq ans à l'Université George Mason: le Dr Joseph J. Pancrazio, le Dr Hamid Charkhkar, le Dr Gretchen Knaack , Le Dr Franz Hamilton, Michael Maquera et Robert Graham.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4403 | Make 4 mg/mL aliquots |
| B-27 | Invitrogen | 17504-044 | Serum-free supplement for neural cell culture. Make 1 mL aliquots and freeze |
| Beakers - glass - 100 mL | VWR | 13912-160 | |
| Beakers - glass - 500 mL | VWR | 10754-956 | |
| Blunt-tipped thumb forceps | World Precision Instruments | 500365-G | |
| Cryogenic vial - sterile, 2 mL | Fisher Scientific | 10-500-26 | |
| Cryogenic vial - sterile, 5 mL | Fisher Scientific | 10-500-27 | |
| DMEM with Glutamax | Gibco Life Technology | 10569-010 | Cell culture media that contains a stabilized form of L-glutamine |
| DNase | Worthington Biochemical | LK003172 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ATCC | 30-2030 | |
| Fine-tipped thumb forceps | World Precision Instruments | 501324-G | |
| Glass Pipets | VWR | 14673-010 | |
| GlutaMAX -- I (100X) | Gibco Life Technology | 35050-061 | A stabilized form of L-glutamine used as a suplement |
| Hemocytometer chip | Fisher Scientific | 22-600-101 | |
| Hibernate EB complete | BrainBits | D00118 | Ambient CO2 cell storage media |
| Horse Serum | Atlanta Biologicals | S12195H | |
| Laminin | Sigma Aldrich | L2020-1MG | |
| MCS filter amplifier | MultiChannel System | FA60SBC | |
| MCS headstage/pre-amplifier | MultiChannel System | MEA1060-INV | |
| MCS microelectrode array | MultiChannel System | 60MEA200/10iR-ITO | |
| MCS power supply | MultiChannel System | PS20W | |
| MCS signal divider | MultiChannel System | SDMEA | |
| MCS stimulus generator | MultiChannel System | STG4002 | |
| MCS temperature controller | MultiChannel System | TC02 | |
| Media storage bottle - glass 500 mL | VWR | 10754-818 | Autoclave |
| Microcentrifuge tubes - 0.4 mL | Thermo Fisher | 3485 | Autoclave |
| Microcentrifuge tubes - 2 mL | Thermo Fisher | 3434ECONO | Autoclave |
| Micropipette tips - 10 μL | VWR | 37001-166 | Autoclave |
| Micropipette tips - 1,000 μL | VWR | 13503-464 | Autoclave |
| Micropipette tips - 200 μL | VWR | 37001-596 | Autoclave |
| Micropipetter - 10 μL | Thermo Fisher | 4641170N | |
| Micropipetter - 1,000 μL | Thermo Fisher | 4641210N | |
| Micropipetter - 200 μL | Thermo Fisher | 4641230N | |
| Papain - 0.22 Filtered | Worthington Biochemical | LK003178 | |
| Penicillin-Streptomycin (Pen Strep) | Thermo Fisher | 15070063 | |
| Petri dishes -100 mm disposable | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
| Petri dishes -100 mm glass | VWR | 10754-788 | |
| Petri dishes -35 mm | Fisher Scientific | 08-757-100A | |
| Phosphate buffer saline (PBS) (1x) | Corning | 21-040-CV | |
| Plasma Cleaning System | Plasma Etch, Inc. | PE-50 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) | Sigma Aldrich | P6407-5MG | |
| Polyethylene conical (centrifuge) tube -15 mL | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
| Polypropylene conical (centrifuge) tube -50 mL | Falcon | 352070 | |
| Procedure masks | Imco | 1530-imc | |
| Pyruvate | Sigma Aldrich | P4562-5G | |
| Scalpel blades | World Precision Instruments | 500237-G | |
| Scissors - iris | World Precision Instruments | 14111-G | |
| Scissors - large | World Precision Instruments | 14214 | |
| Scissors - small surgical | World Precision Instruments | 501733-G | |
| Serological pipette - sterile, 1 mL | VWR | 89130-892 | |
| Serological pipette - sterile, 2 mL | VWR | 89130-894 | |
| Serological pipette - sterile, 25 mL | VWR | 89130-900 | |
| Serological pipette - sterile, 50 mL | VWR | 89130-902 | |
| Software: Matlab GUI | Peixoto Lab | npeixoto@gmu.edu | Used to analyze .mat files. Available for free upon request. Contact npeixoto@gmu.edu to request a copy. |
| Software: MCS MC_Rack | MultiChannel System | N/A | Used for data acquisition |
| Software: NeuroExplorer | Plexon | http://www.plexon.com/products/neuroexplorer | Used to convert .nex files to .mat |
| Software: Offline Sorter | Plexon | http://www.plexon.com/products/offline-sorter | Used to sort neural spikes and convert data files to .plx and then to .nex |
| Software Manual: MCS MC_Rack | MultiChannel System | https://www.multichannelsystems.com/sites/multichannelsystems.com/files/documents/manuals/MC_Rack_Manual.pdf | |
| Software Manual: NeuroExplorer | Plexon | https://www.neuroexplorer.com/downloads/Nex3Manual.pdf | |
| Software Manual: Offline Sorter | Plexon | www.plexon.com/system/files/downloads/Offline%20Sorter%20v2.8%20Manual.pdf | |
| Spatula - small double-ended | World Precision Instruments | 503440 | |
| Stericup 0.22 µm pore filter - 250 mL | Millipore | SCGVU02RE | |
| Transfer pipette - large bore | Thermo Fisher | 335-1S | |
| Transfer pipette - small bore | Thermo Fisher | 242-1S | |
| Trypan blue | Sigma Aldrich | T8154-20ML | |
| Whatman filter paper | Whatman | 1442 150 | Cut into 8 pie wedges and autoclave in a glass Petri dish |
References
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