Summary
Her beskriver vi en protokoll for microinjection i gnager hjernen som bruker kvarts nåler. Nålene ikke produsere synlig vevsskade og sikre pålitelige leveranser selv i dyp regioner. Videre de kan tilpasses behov av personlig design og kan brukes på nytt.
Abstract
Microinjections har vært brukt i lang tid for levering av narkotika eller giftstoffer i bestemte hjernen områder og, mer nylig de har blitt brukt til å levere genet eller cellen terapi produkter. Dessverre dagens microinjection teknikker bruke stål eller glass nåler som er suboptimal for flere grunner: spesielt stål nåler kan skade vev og glass nåler kan bøye når senket dypt inn i hjernen, mangler målregion. I denne artikkelen beskriver vi en protokoll for å klargjøre og bruke quartz nåler som kombinerer en rekke nyttige funksjoner. Nålene produserer ikke synlig vevsskade, og å være veldig stive, sikre pålitelige leveranser i ønsket hjernen regionen selv når bruker dyp koordinater. Videre er det mulig å tilpasse utformingen av nålen ved å lage flere hull av ønsket diameter. Flere hull lette injeksjon av store mengder løsning i et større område, mens store hull lette injeksjon av celler. I tillegg kan nålene kvarts rengjøres og brukes på nytt, slik at prosedyren blir kostnadseffektiv.
Introduction
Microinjections har blitt brukt i lang tid for levering av farmakologisk aktive forbindelser for å modulere neuronal aktivitet i bestemte hjernen områder. Dessuten, har de blitt brukt til å injisere giftstoffer nær bestemt neuronal befolkninger, å etterligne nevrodegenerative hendelser karakteristisk for visse sykdommer, for eksempel 6-hydroxy-dopamin i nigrostriatal dopamin systemet å etterligne Parkinsons sykdom 1 , 2 eller immunotoxin 192 IgG saporin til lesjon cholinergic system3. Nylig har microinjection prosedyrer blitt brukt til å levere viral vektorer eller celler grafts for genet eller cellen terapi eksperimentell hjernen lidelser4,5.
Klassisk typen nåler i disse studiene er laget av rustfritt stål. Selv om enkel og praktisk å bruke, stål nåler har en rekke problemer6: de er relativt stor og kan skade vev, lekkasje av blod - hjerne barrieren og aktivering av astrocyttene; Videre kan de produserer prøvetaking av hjernevev som kommer inn nålen oppretter et hinder eller selv helt unngå flyten av ønsket løsningen. Flere nylig, glass nåler forberedt adhoc fra kapillærene er innført i bruk7,8. Dette gir betydelige vev skade eller astrocytter aktivisering, men er relativt fleksible og kan bøye når introdusert i dype strukturer, redusere nøyaktigheten av lokalisering (personlige observasjoner).
Det er derfor behov for å redusere så mye som mulig skade (særlig når utføre eksperimenter for å helbrede skaden) samtidig øke nøyaktigheten og reproduserbarhet (dvs., sikre at alle løsning leveres og sikre riktig lokalisering). Dessuten ville det være ønskelig å bruke ulike nålen design for å sikre optimal fordeling av injisert løsningen i hjernen områder med varierende geometri. I denne artikkelen beskriver vi en protokoll for å klargjøre og bruke quartz nåler for microinjections i gnager hjernen. Det høyt smeltepunktet, kvarts kapillærene ikke kan trekkes på en vanlig avtrekker og derfor ikke har vært brukt tidligere for å generere nåler. Kvarts, men tilbyr noen viktige fordeler over glass, spesielt høy stivhet og bryte motstand9. På grunn av deres stivhet, er kvarts nåler ideell for injeksjoner i ventrale hjernen regioner. På grunn av deres høy motstand mot brudd kan de modelleres for å inkludere flere hull, skaffe design som kan bli mest effektivt selv når målretting hjernen med komplekse geometrier10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle protokoller ble godkjent av universitetet av Ferrara etiske komiteen for dyr eksperimentering og italiensk Helsedepartementet. ANKOMME (dyr forskning: rapportering i Vivo eksperimenter11) retningslinjer er fulgt.
1. forberedelse av kvarts nåler
- Rengjøres og steriliseres kvarts kapillærene (se Tabell for materiale) ved å plassere dem for 5 min med destillert vann, 5 min i etanol 99% og 5 minutter i diethyl-Eter.
- La capillaries under panseret minst 1 h å la dem tørke.
- Forberede nålene bruker en laser avtrekker etter parametere at produksjonen av tilstrekkelig lenge, tilstrekkelig tynn nål, avhengig av individuelle behov.
Merk: Vi bruker en laser avtrekker (se Tabell for materiale). Bruke et to linjer program for trekking. Den første linjen bruker høy effekt, største skanning lengden (tilsvarende FILAMENTER verdi) og ingen trekke kraft. Denne kombinasjonen av parametere fører til smelting av den største delen av kapillær med lavest forlengelsen hastighet, slik at utformingen av en lang nål med store indre/ekstern størrelse og redusert skaft. På denne måten beholder nålen en høy mekanisk motstand og bred indre diameter som tillater passasje av stamceller eller virus partikler uten tilstopping. Hastighet og forsinkelse av programmet linjen skal slutte kapillær filtypen før spissen blir for liten og lang, mangler den nødvendige mekaniske og formen egenskaper. Den andre linjen av programmet trekke utføres automatisk når kvarts kjøles ned (5 s). Parametere av kraft, filament og trekke kraft er funksjonelle å skjære et tips med kortest mulig tips lengde og bratte skaft, unngå separasjon av de to pinnene med et tips brudd. Rutinemessig, med utstyret vi bruker følgende: (a) linje 1 = power 990, filament 5, hastighet 130, forsinkelse 110, trekke 0; (b) linje 2 = power 970, filament 3, hastighet 0, forsinkelse 70, trekke 0. - Sett pinnene i en Petriskål tidligere rengjøres med etanol 70%.
- Dekk parabolen med en plast parafin film.
- Klipp kapillærene mikro-dissector.
- På oppstart, la laser kjøre en kalibrering prosess for å kontrollere kraften og energi levert. Deretter Angi parameterne kutte.
Merk: Vi bruker en mikro-dissector (se Tabell for materiale) og følgende parametere: laser puls energi (63 µJ), laser strålen diameter på 20% av maksimal blenderåpning (maksimal blenderåpning: 1.0 µm), og 10% av maksimal hastighet (maksimal hastighet hastighet: 30 µm/s). - Fast fastsette nålen på tabellen mikroskop og plasser spissen sin på midten av skjermen.
- På menylinjen klikker blyantikonet og bruke den til å tegne et merke for laserskjæring nålen.
Merk: Kuttet bør være i en vinkel på ca 45 ° forhold til p overflaten. - Velg flagget med knappen "START CUT" slik at laseren å kutte tidligere merket stedet funksjonen side bar.
- Hvis nødvendig, kuttet side hole(s) ved å gjenta fremgangsmåtene i 1.5.2-3; Det er ikke nødvendig å flytte nålen (figur 1).
- På oppstart, la laser kjøre en kalibrering prosess for å kontrollere kraften og energi levert. Deretter Angi parameterne kutte.
- Skjær etter rengjøring.
- Koble nålen til en ugyldig pumpe gjennom et plastrør.
- Slå på pumpen og manuelt satt frem infusjonshastigheten i moderat fart (3 µL/min).
- Sug opp 99% etanol først og deretter destillert vann for å fjerne urenheter på grunn av skjæring.
- Sug opp 99% etanol igjen for å lette tørking.
Merk: Hvert trinn skal vare i minst 3 minutter.
- Lagre nålene i en riktig dekket Petriskål inntil dag kirurgi.
- Nåler kan brukes på nytt; på slutten av eksperimentet, rengjøre med blekemiddel og etanol fjerne løsningen og mulig vev rester. For en mer fullstendig rengjøring, satt nålene i en brønnene lagring krukke med spissen peker nedover, fyll glasset med destillert vann til tipsene er dekket, koke i 1,5 min å fjerne alle leftover vev, og vask med etanol.
2. fremgangsmåte
- Etter instruksjonene fra pumpen brukerhåndboken, Velg innstillingsmenyen for å kalibrere pumpen etter diameter/volumet av microinjection og angi flow rate på 0,3 µL/min.
- Fyll en 10-mL sprøyte (utstyrt med en stump nål (f.eks, Hamilton nål, 30 G) og en kort polytetrafluoroethylene tube) med sterilt vann og bruke den til å fylle microinjection sprøyten (etter å ha svært forsiktig fjernet stempelet) og injeksjon monteringssett for deler for manuell microinjection pumpen (MMP).
Merk: MMP kit til å sikkert montere nålen i stereotactic rammen (figur 2). Kit inneholder: en polytetrafluoroethylene rør, luer-til-slange coupler, pipette holder og pakninger til Pipetter med ulike ytre diameter. - Koble nålen MMP Kit.
- Tømme mer vann over systemet gjennom 10-mL sprøyte, og kontroller om vannet kommer ut av nålen.
Merk: Pass på å fjerne en luftboble i systemet ved å gjenta trinnene fylling.
- Tømme mer vann over systemet gjennom 10-mL sprøyte, og kontroller om vannet kommer ut av nålen.
- Koble den 10-mL sprøyten fra microinjection sprøyten mens sakte skyve stempelet for å forlate en dråpe vann på toppen av microinjection. Sette inn stempelet i microinjection sprøyten.
- Koble microinjection sprøyten til pumpen og angi flow rate på 0,3 µL/min.
Merk: Vent til det er et fall lekker fra spissen av nålen og så la det gå for en annen 3 min. - Angi flyten på 0,1 µL/min og begynn kirurgi. Pumpen skal pågående mens du utfører operasjonen.
Merk: Eksperimenter i denne artikkelen, bruker vi Sprague Dawley hannrotter 300 g (3 måneder gammel). Imidlertid er prosedyren gjelder for andre arter, mus spesielt. - Indusere narkose bruke en godkjent av lokale bestemmelser.
Merk: Vi bruker en blanding av intraperitoneal injeksjon (IP) av 85 mg/kg ketamin og 8 mg/kg xylazine for 20-50 min av anestesi. Det er viktig at halen og/eller toe pinches brukes til å sikre dyret er helt bedøvet. Anestesi og grunnleggende vitals vurderes før operasjonen begynner og overvåket hvert 10 min mens du utfører operasjonen. Dyr kroppstemperatur opprettholdes konstant før, under og etter kirurgiske prosedyrer som bruker vann re-sirkulerer varmeputen. Dyr overvåkes til helt frisk (f.eks de er oppreist og ambulerende). I tillegg få dyrene analgetika (tramadol, 5 – 7 mg/kg IP) post-operatively hver 24 h i tre dager.- Barbere at dyret og tilstrekkelig forberede kirurgiske området for aseptiske kirurgi. Utføre en totrinns scrub med jod-basert løsning (Betadine) etterfulgt av 70% etanol. Videre, for å opprettholde asepsis, bryte kirurgiske området med en kirurgisk drapere (i videoen er utelatt for demonstrering).
- Plasser rotta i stereotaxic rammen over vann re-sirkulerer oppvarming teppe. For å gi ekstra smertelindring, på stedet av kirurgi bruke 0,5% lidocaine løsning (ikke overskrider 7 mg/kg). Pre sterilisere alle kirurgiske instrumenter med en perle sterilisere eller flytende kaldt desinfeksjon ved immerging utstyret i enten 2% glutaraldehyde pluss 7.05% fenol (Sporodicin eller Cidex) etterfulgt av skylling med sterilt vann eller saltløsning. Desinfeksjon må utføres mellom prosedyrer. Gjøre en langsgående kutt over skallen med sterilisert skalpell. Være forsiktig å unngå overdreven blødning. Åpne hodebunnen med en flat slikkepott og bruke kirurgisk klipp på flaps av huden for å holde den åpen. Forsiktig, løsne periosteum for å avsløre bregma og området av skallen gjennom nålen settes.
- Montere armen på stereotaxic ramme (mens strømmen pågår) og flytte tuppen av nålen akkurat på bregma, betalende oppmerksomhet ikke å bryte sine tips. Kommentere antero-bakre og medio-lateral koordinatene for bregma og oversette til ønsket koordinatene. Guidet av en stereomicroscope, lavere nålen til spissen sin nesten berører skallen, markere boring stedet etter heve litt stereotaxic armen.
- Bore (bore tips Ø: 0,8 mm, drill hastighet: 1000 rpm) skallen på merket stedet. Hensyn må tas ikke å trenge dura under boring prosedyrene. Boring, dryppe sterilt saltvann å unngå bone skade og nekrose.
- Skjær et lite stykke plast parafin film og plassere den på skallen. Bruke 10 µL Pipetter, lage en dråpe løsningen å injisere på plast parafin filmen. Stopper pumpen, litt hente overflate av pumpen og lage litt luftboble i av kapillær ved forsiktig dra stempelet av microinjection.
- Lavere stereotactic armen til spissen av nålen når drop. Tegne prøven ved å trekke (svært sakte) stempelet av microinjection, unngå noen boble-formasjonen. Erstatte pumpen overflate kontakt med stempelet og slå på pumpen på en strømningshastighet på 0,3 µL/min. vente til dannelsen av en dråpe (noen min) før du fortsetter til neste trinn.
Merk: I dagens eksempel eksperimentet, kunstige cerebrospinalvæske (aCSF) ble fylt i striatum (AP: +1.5, ML: ±2.7; DV:-5.0) og dorsal prefiks (AP: -3,5, ML: ±2.1; DV: -3,5; i mm fra dura), 2 µL/nettsted. For å lette sammenligningen mellom de to injection metodene, ble hver brain området fylt med en kvarts nål i en halvkule og en 26 G butt tupp eller en 30 G skråkant-tip rustfritt stål nål i den andre. - Lavere flyten til 0,1 µL/min, nick dura med en stål skråkant-tip nål og senke sakte stereotactic armen på dorso-ventrale øksen, inn hjernevev. Når ønsket posisjon er nådd, gå ned en ekstra 0,1 mm, stopper pumpen, øke stereotactic armen av 0,1 mm og starte igjen pumpen på en flyt på 0,3 µL/min.
Merk: Grunnen til å opprettholde en langsom flow mens senking nålen er å sikre et positivt trykk som unngår gjennomtrengning av små fragmenter av vev i nålen selv. Slik hendelse ville hindre spissen, svekker levering av løsning. Siden infusjonshastigheten er veldig sakte senke nålen og hastigheten på senking er ca 10 s/mm, innebærer dette at beløpene løsning som forblir langs nål sporet er ubetydelig sammenlignet med de injisert på målområdet. Denne forholdsregelen kan unngås ved nåler med siden hull. - Starte tidtakeren og venter den nødvendige tiden avhengig av det ønskede volumet å injisere (eksempelvis 6 min 40 s Hvis sprøytebruk 2 µL). Overvåke boble bevegelse mens sprøytebruk. På slutten, stopper pumpen og vent på 5 minutter før du henter sakte nålen. Når kvarts nålen er helt hentes, VistaLoader pumpen og sjekk for dannelsen av en nedgang på spissen av nålen.
- Forsegle åpningen i skallen overflaten med bein voks, fjerne hemostatic klippene og Sutur hodebunnen, pels området rundt såret med en antibiotikumet kremen (f.eks, neosporin) og returnerer dyret til hjem buret.
Merk: Etter euthanasia protokollen godkjent av institusjonelle etiske komiteen, for eksperimenter beskrevet i denne artikkelen, dyr var dypt anesthetized med sprøytene IP 43 mg/kg ketamin og 7 mg/kg xylazine og decapitated. Hjernen ble fjernet, postfixed i formalin for 48 h og parafin innebygd. Framskaffet (8 µm) av hjernen var skiver med en mikrotom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi sammenlignet skade forårsaket av direkte microinjection i rotte dorsal hippocampus og striatum bruker en kvarts nål (60 µM ytre diameter tips, en 20 µM diameter siden hull, type C, figur 1) sammenlignet med to classic, 26 G sløv slutten og 30 G skråkant kanten rustfritt stål nåler. Til dette målet, vi injisert 2 µL av aCSF til høyre og venstre dorsal hippocampus og striatum med henholdsvis av kvarts og stål nål og, 48 timer etter injeksjon, vi vurdert vevsskade bruker den Hematoxylin-Eosin (HE) flekker. Vi valgte et tidlig tidspunkt etter injeksjon til bedre sette pris på den akutte mekaniske produsert av forskjellige nålene (på tid, vev reparasjonsmekanismene kunne skjule opprinnelige skaden)7.
Etter protokoll beskrevet ovenfor, produserer kvarts nålen ikke synlig skade og en knapt synlig p spor, mens hjernen regioner injisert gjennom 26 G stål sløv slutten nålen utstilt en markert skade (Figur 3). 30 G skråkant vinkel (30 °) rustfritt stål nålen indusert en mer begrenset, men tydelig synlig hjernen leksjonen i striatum (figur 4B) og dorsal prefiks (figur 5). For å bevise at injeksjon av aCSF var like vellykket med pinner, i et separat sett av eksperimenter injisert vi 2 µL Trypan blå (figur 4A). Viktigere, alle Hentet kvarts nåler var helt intakt, dvsvi aldri observert noen skade ved innsetting manøvrene.
Figur 1: mikroskopiske bildet av en kvarts pinne-spissen, viser forskjellige diametere av tips og hull ansatt for injeksjon av væsker. Lav forstørrelse bilde i (A) og høyere forstørrelse med (B) og (C). Nålen kan tilberedes i ulike manerer (forskjellig lengde, hull tall og hull dimensjoner) ifølge anatomien i hjernen regionen, spre målet og viskositet av løsningen, som illustrert i (B) og (C). Merke glatt kuttet av hull og tips får strømsparingsmodus laser microdissection. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: definert for microinjections. Bildet viser settet brukes til å sikre kvarts Pipetter (venstre) og rustfritt stål nålen (høyre) til den stereotactic micropositioner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: framskaffet viser mindre skade ved hjelp av quartz nålen. Framskaffet (8 µm tykkelse) rotte hjerner på nivået av striatum viser en sammenligning mellom skade produsere ved injeksjon av 2 µL aCSF bruker en kvarts nål som vist i figur 1 c (venstre) og en 26 G sløv slutten rustfritt stål nål (riggen HT-siden). Noen skade ble produsert i cortex på siden av kvarts nålen, på grunn av feil dypt boring skallen. Disse bildene, tatt fra to forskjellige dyr, er representant for alle 5 dyr med i eksperimentet (skala bar = 500 µm). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: spre og vevsskade. (A) distribusjon av Trypan blå injisert i striatum med en kvarts nål (venstre), sammenlignet med en 30 G skråkant kanten rustfritt stål nål (høyre). (B) koronale delen av rotte hjernen på nivået av striatum, beiset med han viser en sammenligning mellom en kvarts nål og en 30 G skråkant kanten rustfritt stål nål (skala bar = 500 µm). I boksene (venstre og høyre), en høyere forstørrelse av skaden (skala bar = 200 μm, 10 X). Disse bildene er representant for 5 dyr med i eksperimentet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: skade forårsaket av en kvarts nål og en 26 G skråkant kanten rustfritt stål nål på nivå med dorsal hippocampus. De to tilfellene vises her er representant for 5 dyr med i eksperimentet (skala bar = 400 µm). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Teknikken er beskrevet i denne artikkelen oppfyller behovene i innføring for å optimalisere microinjections som utføres for ulike formål12. Nålene beskrevet her redusere skadene til et minimum, i hovedsak ikke-detectable nivå; avvik med glass nåler (som er utsatt for bøye), kvarts nåler er stive og sikre en pålitelig rammet av ønsket hjernen regionen i dyp koordinater. Videre sikrer siden hullet levering av løsningen selv om tips hullet blir okkludert under innsetting i hjernevevet.
Begrensninger og alternativer. På grunn av høyt Smeltepunkt, kvarts kapillærene ikke kan trekkes på en vanlig avtrekker, dvs., de krever tilgang til dyrt utstyr. Glass kapillærene er like gode i form av unngå skade på vev, men mindre pålitelig for injeksjoner i dype strukturer og mer skjør (dvs.mindre fleksibel i design). Men hvis målet er injeksjon i overfladisk strukturer som cortex eller dorsal hippocampus og det er ingen krav for flere hull som ville øke risikoen for p bryte, representerer glass nåler sikkert en gyldig og billig alternativ.
En begrensning av både kvarts og glass nåler er at de ikke tillater flere injeksjoner på forskjellige tidspunkt, som stål nåler kombinert for å lede cannulas. Derfor fortsatt stål nåler det beste alternativet for disse programmene, med råd å unngå relativt store (26 G) og/eller sløv kanten nåler.
Kritisk trinn i protokollen. Samlet protokollen beskrevet ovenfor er veldig enkelt og bør ikke være vanskelig å bruke for noen forsker opplevd i microinjections. Når nålene er gjort tilgjengelig, sikrer vanlige forholdsregler ansatt for anestesi, kirurgi, langsom innsetting og fjerning av nålen, konstant og treg hastighet på infusjonen regulert av en minipump, god og reproduserbar.
Fordeler og videre utvikling. Som nevnt ovenfor, er den viktigste fordelen av kvarts nåler å par minimal mekaniske med mulighet for å tilpasse utformingen av nålen. Vi forberedt nåler med flere hull og forskjellige diametere, som kan tilpasses de eksperimentelle behov. For eksempel kan forskjellige diametere være nødvendig å injisere viral vektorer og celler sammenlignet med narkotika eller giftstoffer; flere hull kan være nyttig å sikre injeksjon av større mengder løsning i et større område og kan bli spesielt nyttig for vanskelig geometri hjernen områder. Den store allsidigheten av denne teknikken kan også utnyttes for å optimalisere spredningen i vevet av viral vektorer for genterapi eller celler. Faktisk bruker vi nålene for å injisere viral vektorer eller celler.
Andre fordeler inkluderer muligheten til å bruke nålene. Gjør kan nåler rengjøres med etanol og blekemiddel å fjerne løsningen og mulig vev rester. Gjentatt bruk av en enkelt nål kan gjøre prosedyren kostnadseffektiv tross den relativt høye kostnadene ved produksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet har blitt støttet av et stipend fra det europeiske fellesskap [FP7-folk-2011-IAPP prosjekt 285827 (EPIXCHANGE)].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Quartz capillaries | Sutter Instruments, Novato, CA USA | Q100-50-10 | Without filament |
| Puller | Sutter | P2000 | |
| Micropipette storage jar | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | E210 | |
| Laser microdissector | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | LMD6500 | |
| Hamilton syringe | Hamilton ILS Innovative Labor Systeme GmbH, StŸtzerbach, Germany | 19138-U | |
| Microinfusion pump | Univentor, Zejtun, Malta | Model 864 | |
| Manual microinjection pump kit | WPI | Item#: MMP-KIT | Kit allowing for micropipettes to be securely mounted to the stereotactic frame |
| Precision Drill | Proxxon | 28510 MicroMot 50/E | Ball bearing drive shaft with variable speed |
| Artficial Cerebral Spinal Fluid | Tocris | 3525 | |
| Needles 26 G Blunt and 30 G Bevel | Hamilton | 26 G Blunt: 19138-U 30 G Bevel: 20757 |
|
| Microtome | Leica, Germany | LEICA RM212RT |
References
- Kirik, D., Rosenblad, C., Björklund, A. Characterization of behavioral and neurodegenerative changes following partial lesions of the nigrostriatal dopamine system induced by intrastriatal 6-hydroxydopamine in the rat. Exp Neurol. 152 (2), 259-277 (1998).
- Paolone, G., Brugnoli, A., Arcuri, A., Mercatelli, D., Morari, M. Eltoprazine prevents levodopa-induced dyskinesias by reducing striatal glutamate and direct pathway activity. Mov Disord. 30 (13), 1728-1738 (2015).
- Paolone, G., Lee, T. M., Sarter, M. Time to pay attention: attentional performance time-stamped prefrontal cholinergic activation, diurnality, and performance. J Neurosci. 32 (35), 12115-12128 (2012).
- Shoichet, M. S., Winn, S. R. Cell delivery to the central nervous system. Adv Drug Deliv Rev. 42, 81-102 (2000).
- Simonato, M., et al. Progress in gene therapy for neurological disorders. Nature RevNeurol. 9, 277-291 (2013).
- Björklund, H., Olson, L., Hahl, D., Schwarcz, R. Short-and Long-Term Consequences of Intracranial Injections of the Excitotoxin, Quinolinic Acid, as Evidenced by GFA Immunohistochemistry of Astrocytes. Brain Res. 317, 267-277 (1986).
- Paradiso, B., et al. Localized delivery of fibroblast growth factor-2 and brain-derived neurotrophic factor reduces spontaneous seizures in an epilepsy model. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (17), 7191-7196 (2009).
- Falcicchia, C., et al. Silencing Status Epilepticus-Induced BDNF Expression with Herpes Simplex Virus Type-1 Based Amplicon Vectors. PLoS One. 11 (3), 1-17 (2016).
- Munoz, J. L., Coles, J. A. Quartz micropipettes for intracellular voltage microelectrodes and ion-selective microelectrodes. J Neurosci Meth. 22 (1), 57-64 (1987).
- Sutter Instruments. P-2000: Laser-Based Micropipette Puller. , Available from: http://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-2000.html (2017).
- Kilkenny, C., Browne, W., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Animal research: reporting in vivo experiments: the ARRIVE guidelines. J Cereb Blood Flow Metab. 31, 991-993 (2011).
- Torres, E. M., Trigano, M., Dunnett, S. B. Translation of cell therapies to the clinic: characteristics of cell suspensions in large-diameter injection cannulae. Cell Transplant. 24, 737-749 (2015).
