بروتوكول محسن لاستخراج البروتينات من صمام ميترال الإنسان
Summary
تكوين البروتين من صمام الصمام التاجي البشري لا يزال غير معروف جزئيا، لأن تحليله معقد من قبل الخلوية منخفضة، وبالتالي من خلال انخفاض البروتين الحيوي. هذا العمل يوفر بروتوكول لاستخراج البروتين بكفاءة لتحليل بروتيوم صمام الصمام التاجي.
Abstract
تحليل بروتيوم الخلوية يمكن أن تساعد على توضيح الآليات الجزيئية الكامنة الأمراض بسبب تطوير التكنولوجيات التي تسمح على نطاق واسع تحديد وكمية من البروتينات الموجودة في النظم البيولوجية المعقدة.المعرفة المكتسبة من نهج البروتين يمكن أن تؤدي إلى فهم أفضل للآليات المسببة للأمراض الكامنة وراء الأمراض، والسماح لتحديد علامات التشخيص والتشخيص الرواية جديدة، ونأمل، من الأهداف العلاجية. ومع ذلك، فإن الصمام التاجي القلب يمثل عينة صعبة للغاية لتحليل البروتين بسبب انخفاض الخلوية في بروتيوغليكان والمصفوفة خارج الخلية المخصب الكولاجين. وهذا يجعل من الصعب استخراج البروتينات لتحليل البروتين العالمي. يصف هذا العمل بروتوكول متوافق مع تحليل البروتين لاحق، مثل البروتينات الكمية و إمونوبلوتينغ. وهذا يمكن أن يسمح للارتباط البيانات قلقز التعبير البروتين مع البيانات على التعبير الكمي مرنا وغير الكمي تحليل المناعية. في الواقع، هذه النهج، عندما يؤديها معا، سيؤدي إلى فهم أكثر شمولا للآليات الجزيئية الكامنة وراء الأمراض، من مرنا إلى ما بعد متعدية تعديل البروتين. وهكذا، يمكن لهذه الطريقة تكون ذات صلة للباحثين المهتمين في دراسة أمراض القلب صمام فيسيوباثولوغي.
Introduction
وقد غيرت الأدلة الأخيرة فهم أدوار الآليات التنظيمية العديدة التي تحدث بعد التوليف مرنا. في الواقع، عمليات متعدية، ما بعد النسخي، وعمليات بروتين يمكن أن تنظم بروتين وفرة وظيفة. العقيدة – التي تقول أن تركيزات مرنا هي بروكسيات لتلك التي من البروتينات المقابلة، على افتراض أن مستويات النص هي المحدد الرئيسي للوفرة البروتين – وقد تم تنقيح جزئي. في المقام الأول، ومستويات النص تتنبأ جزئيا فقط وفرة البروتين، مما يشير إلى أن أحداث ما بعد النسخي تحدث لتنظيم البروتينات داخل الخلايا 1 ، 2 .
وعلاوة على ذلك، والبروتينات تملي في نهاية المطاف وظيفة الخلية، وبالتالي تملي النمط الظاهري، والتي يمكن أن تخضع لتغييرات ديناميكية في الاستجابة لعقاقير أوتوكرين، باراكرين، والغدد الصماء. الوسطاء المنقولين بالدم؛ درجة الحرارة؛ العلاج من الإدمان؛ وتطور المرضمنة. وهكذا، فإن تحليل التعبير تركز على مستوى البروتين مفيد لتوصيف بروتيوم وكشف التغيرات الحرجة التي تحدث لها كجزء من المرضية المرض 3 .
ولذلك، فإن الفرص التي توفرها البروتيوميات لتوضيح الظروف الصحية والمرضية هائلة، على الرغم من التحديات التكنولوجية القائمة. المجالات الواعدة بشكل خاص للبحوث التي يمكن أن تسهم بروتيوميكس: تحديد تغيير التعبير البروتين على أي مستوى ( أي خلايا كاملة أو الأنسجة، المقصورات تحت الخلوية، والسوائل البيولوجية). وتحديد والتحقق، والتحقق من المؤشرات الحيوية الرواية مفيدة لتشخيص وتشخيص المرض. ونأمل، وتحديد أهداف البروتين الجديدة التي يمكن استخدامها لأغراض علاجية، فضلا عن تقييم فعالية الدواء والسمية 4 .
التقاط تعقيديمثل البروتيوم تحديا تكنولوجيا. أدوات البروتين الحالية توفر الفرصة لأداء تحليل واسع النطاق، عالية الإنتاجية لتحديد، الكمي، والتحقق من صحة مستويات البروتين المتغيرة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن إدخال تقنيات تجزئة وإثراء، وتهدف إلى تجنب التدخل الناجم عن البروتينات الأكثر وفرة، كما تحسنت تحديد البروتين من خلال تضمين البروتينات الأقل وفرة. وأخيرا، تم تكملة البروتيوميات من خلال تحليل التعديلات بعد متعدية، والتي تظهر تدريجيا كمغيرات هامة من وظيفة البروتين.
ومع ذلك، فإن إعداد العينة واستعادة البروتين في العينات البيولوجية تحت التحليل لا تزال الخطوات المحددة في سير العمل البروتين وزيادة إمكانية وقوع المزالق المحتملة 5 . في الواقع، في معظم تقنيات البيولوجيا الجزيئية التي يجب أن تكون الأمثل، والخطوات الأولى هي الأنسجة هوموجينيزاتأيون وتحلل الخلية، وخصوصا خلال تحليل البروتينات وفرة منخفضة التي أساليب التضخيم لا وجود لها. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الطبيعة الكيميائية للبروتينات يمكن أن تؤثر على الانتعاش الخاصة بهم. على سبيل المثال، تحليل البروتينات مسعور للغاية صعبة للغاية، لأنها تتعجل بسهولة خلال التركيز إسويلكتريك، في حين البروتينات عبر غشاء تقريبا غير قابلة للذوبان (راجع في المرجع 5). وعلاوة على ذلك، فإن تقلب تكوين الأنسجة يخلق حاجزا كبيرا لتطوير طريقة استخراج عالمية. وأخيرا، لأن ما يقرب من جميع العينات السريرية هي من كمية محدودة، فمن الضروري لتمكين إعداد البروتين مع الانتعاش القصوى والتكاثر من الحد الأدنى من كميات عينة 6 .
يصف هذا العمل بروتوكول الأمثل لاستخراج البروتين من صمام القلب التاجي البشري العادي، الذي يمثل عينة صعبة للغاية لتحليل البروتين. صمام التاجي العادي هو كومبهيكل ليكس الكذب بين الأذين الأيسر والبطين الأيسر للقلب ( الشكل 1 ). فإنه يلعب دورا هاما في السيطرة على تدفق الدم من الأذين إلى البطين، ومنع ارتجاعي وضمان المستوى المناسب من إمدادات الأكسجين إلى الجسم كله، وبالتالي الحفاظ على الناتج القلبي الكافي. ومع ذلك، فإنه غالبا ما يعتبر أن يكون "غير نشط" الأنسجة، مع الخلوية منخفضة وعدد قليل من المكونات، وذلك أساسا في المصفوفة خارج الخلية. وذلك لأنه، في الظروف العادية، الخلايا الخلوية صمام المقيمين (فيكس) تقديم النمط الظاهري هادئ مع انخفاض معدل البروتين الحيوي 7 .
ومع ذلك، فقد ثبت أنه في حالة المرضية، وعدد من مراكز فيينا الدولية في زيادة الإسفنجية وتفعيل تخليق البروتين، جنبا إلى جنب مع غيرها من التغيرات الوظيفية والمظاهر الظاهرية 8 . ولذلك، فإنه ليس من المستغرب أن الحد الأدنى من البيانات المتاحة فيوتركز الأدب على تحليل الصمامات التاجية المرضية 9 ، 10 ، والتي قد زيادة عدد فيك المنشط قد يفسر العدد المرتفع نسبيا من البروتينات التي تم تحديدها.
في الختام، فإن هذا البروتوكول قد تعمل على تطوير فهم الآليات المسببة للأمراض المسؤولة عن أمراض الصمام التاجي من خلال دراسة مكونات بروتين صمام التاجي. والواقع أن الفهم الأكبر للعمليات المرضية الكامنة يمكن أن يساعد على تحسين الإدارة السريرية لأمراض الصمامات التي تعتمد مؤشراتها الحالية للتدخل إلى حد كبير على اعتبارات الدورة الدموية.
Protocol
Representative Results
Discussion
خطوة واحدة حاسمة من هذا البروتوكول هو استخدام النيتروجين السائل لتجميد العينة والبرد نظام طاحونة. إن استخدام النيتروجين السائل يمنع التدهور البيولوجي ويسمح بالمسحوق الفعال، ولكنه يتطلب تدريبا خاصا للتعامل الآمن.
في هذا البروت?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعمت وزارة الصحة الإيطالية هذه الدراسة (أرسي 2013-بيو 15). نشكر باربرا ميشيلي لمساعدتها التقنية الممتازة.
Materials
| Saline solution | 0.9 % NaCl | ||
| Eurocollins A | SALF | 30874046 | Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins |
| Eurocollins B | SALF | 30874022 | Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins |
| Wisconsin | Bridge life | RM/N 4081 | Balanced organ's transport medium |
| Biohazard vertical flow air | Burdinola | Class A GMP classification | |
| Dewar Flask | Thermo Scientific | Nalgene 4150-1000 | |
| Cryogrinder system | OPS diagnostics | CG 08-01 | Grinder system containing mortars, pestles and screwdriver |
| Stainless steel forceps | |||
| Stainless steel spatula | |||
| Disposable sterile scalpel | Medisafe | MS-10 | |
| Stainless steel scissors | Autoclavable | ||
| Stainless steel picks | Autoclavable | ||
| Disposable sterile drap | Mon&Tex | 3.307.08 | |
| Sterilizing solution with isopropyl alcohol | 70% isopropyl alcohol | ||
| Sterilizing solution with hydrogen peroxide | 6% hydrogen peroxide | ||
| Micropipette, 1 mL, with tips | |||
| 15 mL centrifuge tubes | VWR international | 9278 | |
| 1.7 mL centrifuge tubes | VWR international | PIER90410 | |
| Urea buffer | 8 M urea, 2 M thiourea, 4 % w/v CHAPS, 20 mM Trizma, 55 mM Dithiotreitol | ||
| Urea | Sigma aldrich | U6504-1KG | To be used for Urea buffer |
| Thiourea | Sigma aldrich | T8656 | To be used for Urea buffer |
| CHAPS | Sigma aldrich | C3023-5GR | To be used for Urea buffer |
| Dithiotreitol | Sigma aldrich | D0632-5G | To be used for Urea buffer |
| Syringe 50 mL | PIC | To be used to filter Urea buffer | |
| 0.22 µm filter | Millipore | SLGP033RB | To be used to filter Urea buffer |
| PFTE Pestle, 2 mL | Kartell | 6302 | Part of Potter-Elvehjem homogenizer |
| Borosilicate glass mortar | Kartell | 6102 | Part of Potter-Elvehjem homogenizer |
| Stirrer | VELP scientifica | Stirrer DLH | To be used for homogenization by Potter-Elvehjem |
| Bradford Protein assay | Bio-Rad laboratories | 5000006 | |
| Tube rotator | Pbi International | F205 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Aluminum foil | |||
| Ice | |||
| Polystyrene box | |||
| Dry ice | |||
| Centrifuge | For centrifugation of 1.7 mL centrifuge tubes at 13,000 x g | ||
| Freezer -80°C | |||
| Precision balance | |||
| Autoclave | For sterilization | ||
| Cryogenic gloves for liquid nitrogen | |||
| Gloves | |||
| Professional forced ventilation and natural air convection oven | For sterilization | ||
| Protease inhibitor cocktail | Sigma aldrich | P8340-5ML | 100X solution |
| ProteoExtract Protein Precipitation Kit | Calbiochem | 539180 | |
| RapiGest | Waters | 186001861 | |
| Cytoscape | www.cytoscape.org | version 2.7 | Software platform for Gene Ontology analysis |
| BiNGO | http://apps.cytoscape.org/apps/bingo | version 3.0.3 | Plugin for Gene ontology analysis |
| AlphaB Crystallin/CRYAB Antibody | Novus Biologicals | NBP1-97494 | Mouse monoclonal antibody against CryAB |
| Septin-11 Antibody | Novus Biologicals | NBP1-83824 | Rabbit polyclonal antibody against septin-11 |
| FHL1 Antibody | Novus Biologicals | NBP-188745 | Rabbit polyclonal antibody against FHL-1 |
| Dermatopontin Antibody | Novus Biologicals | NB110-68135 | Rabbit polyclonal antibody against dermatopontin |
| Goat Anti mouse IgG HRP | Sigma aldrich | A4416-0.5ML | Secondary antibody for immunoblotting |
| Goat Anti rabbit IgG HRP | Bio-Rad laboratories | 170-5046 | Secondary antibody for immunoblotting |
Referências
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nat Rev Genet. 13 (4), 227-232 (2012).
- de Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. Global signatures of protein and mRNA expression levels. Mol Biosyst. 5 (12), 1512-1526 (2009).
- Hanash, S. Disease proteomics. Nature. 422 (6928), 226-232 (2003).
- Ahram, M., Petricoin, E. F. Proteomics Discovery of Disease Biomarkers. Biomark Insights. 3, 325-333 (2008).
- Chandramouli, K., Qian, P. Y. Proteomics: challenges, techniques and possibilities to overcome biological sample complexity. Hum Genomics Proteomics. 2009, (2009).
- Singleton, C. Recent advances in bioanalytical sample preparation for LC-MS analysis. Bioanalysis. 4 (9), 1123-1140 (2012).
- Williams, T. H., Jew, J. Y. Is the mitral valve passive flap theory overstated? An active valve is hypothesized. Med Hypotheses. 62 (4), 605-611 (2004).
- Rabkin, E., et al. Activated interstitial myofibroblasts express catabolic enzymes and mediate matrix remodeling in myxomatous heart valves. Circulation. 104 (21), 2525-2532 (2001).
- Martins Cde, O., et al. Distinct mitral valve proteomic profiles in rheumatic heart disease and myxomatous degeneration. Clin Med Insights Cardiol. 8, 79-86 (2014).
- Tan, H. T., et al. Unravelling the proteome of degenerative human mitral valves. Proteomics. 15 (17), 2934-2944 (2015).
- Banfi, C., et al. Proteome of platelets in patients with coronary artery disease. Exp Hematol. 38 (5), 341-350 (2010).
- Banfi, C., et al. Proteomic analysis of human low-density lipoprotein reveals the presence of prenylcysteine lyase, a hydrogen peroxide-generating enzyme. Proteomics. 9 (5), 1344-1352 (2009).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 193 (1), 265-275 (1951).
- Banfi, C., et al. Very low density lipoprotein-mediated signal transduction and plasminogen activator inhibitor type 1 in cultured HepG2 cells. Circ Res. 85 (2), 208-217 (1999).
- Brioschi, M., et al. Normal human mitral valve proteome: A preliminary investigation by gel-based and gel-free proteomic approaches. Electrophoresis. 37 (20), 2633-2643 (2016).
- Brioschi, M., Lento, S., Tremoli, E., Banfi, C. Proteomic analysis of endothelial cell secretome: a means of studying the pleiotropic effects of Hmg-CoA reductase inhibitors. J Proteomics. 78, 346-361 (2013).
- Sun, S., Zhou, J. Y., Yang, W., Zhang, H. Inhibition of protein carbamylation in urea solution using ammonium-containing buffers. Anal Biochem. 446, 76-81 (2014).
- Rabilloud, T., Adessi, C., Giraudel, A., Lunardi, J. Improvement of the solubilization of proteins in two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients. Electrophoresis. 18 (3-4), 307-316 (1997).
- Santoni, V., Molloy, M., Rabilloud, T. Membrane proteins and proteomics: un amour impossible?. Electrophoresis. 21 (6), 1054-1070 (2000).
- Shechter, D., Dormann, H. L., Allis, C. D., Hake, S. B. Extraction, purification and analysis of histones. Nat Protoc. 2 (6), 1445-1457 (2007).
- Fujiki, Y., Hubbard, A. L., Fowler, S., Lazarow, P. B. Isolation of intracellular membranes by means of sodium carbonate treatment: application to endoplasmic reticulum. J Cell Biol. 93 (1), 97-102 (1982).
- Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics. Proteomics. 4 (12), 3665-3685 (2004).
- Mann, M., Kelleher, N. L. Precision proteomics: the case for high resolution and high mass accuracy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18132-18138 (2008).
- Thakur, S. S., et al. Deep and highly sensitive proteome coverage by LC-MS/MS without prefractionation. Mol Cell Proteomics. 10 (8), M110.003699 (2011).
- Loardi, C., et al. Biology of mitral valve prolapse: the harvest is big, but the workers are few. Int J Cardiol. 151 (2), 129-135 (2011).
- Schoen, F. J. Evolving concepts of cardiac valve dynamics: the continuum of development, functional structure, pathobiology, and tissue engineering. Circulation. 118 (18), 1864-1880 (2008).
- Lelovas, P. P., Kostomitsopoulos, N. G., Xanthos, T. T. A comparative anatomic and physiologic overview of the porcine heart. J Am Assoc Lab Anim Sci. 53 (5), 432-438 (2014).
