Geoptimaliseerd Protocol voor de Extractie van Proteïnen uit de Human Mitral Valve
Summary
De eiwitsamenstelling van de menselijke mitrale klep is nog steeds gedeeltelijk onbekend, omdat de analyse ervan gecompliceerd is door lage cellulariteit en derhalve door biosynthese met een lage eiwit. Dit werk biedt een protocol om eiwit efficiënt te extraheren voor de analyse van het mitrale klep proteome.
Abstract
Analyse van het cellulaire proteome kan bijdragen tot het verhelderen van de moleculaire mechanismen die aanliggende ziekten zijn door de ontwikkeling van technologieën die de grootschalige identificatie en kwantificering van de eiwitten in complexe biologische systemen mogelijk maken. De kennis die wordt verkregen uit een proteomische benadering kan mogelijk leiden tot een Beter inzicht hebben in de pathogene mechanismen die onderliggende ziekten liggen, waardoor de diagnose van nieuwe diagnostische en prognostische ziekte markers mogelijk wordt gemaakt, en hopelijk van therapeutische doelen. Echter, de cardiale mitrale klep vertegenwoordigt een zeer uitdagend monster voor proteomische analyse vanwege de lage cellulariteit in proteoglycan en collageenverrijkte extracellulaire matrix. Dit maakt het uitdagend om eiwitten te extraheren voor een globale proteomische analyse. Dit werk beschrijft een protocol dat compatibel is met latere eiwitanalyse, zoals kwantitatieve proteomics en immunoblotting. Dit kan voor de correlatie van gegevens zorgenG eiwit expressie met gegevens over kwantitatieve mRNA expressie en niet-kwantitatieve immunohistochemische analyse. Inderdaad zullen deze benaderingen leiden tot een uitgebreider begrip van de moleculaire mechanismen die onderliggende ziekten liggen, van mRNA tot post-translatie eiwitmodificatie. Zo kan deze methode relevant zijn voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in de studie van hartklep-fysiopathologie.
Introduction
Recent bewijsmateriaal heeft het begrip van de rollen van de vele regulerende mechanismen die na mRNA synthese optreden veranderd. Inderdaad kunnen translatie-, post-transcriptie- en proteolytische processen het eiwit overvloed en functie regelen. Het dogma – dat zegt dat mRNA concentraties proxies zijn aan die van de bijbehorende eiwitten, in het veronderstellen dat transcriptieniveaus de belangrijkste determinant van eiwit overvloed zijn – is gedeeltelijk herzien. In het begin voorspellen transcriptieniveaus slechts gedeeltelijk eiwit overvloed, wat suggereert dat posttranscriptiegebeurtenissen Voorkomen dat de eiwitten in cellen 1 , 2 gereguleerd worden .
Bovendien dicteert eiwitten uiteindelijk de functie van de cel en dicteert daarom zijn fenotype, dat dynamische veranderingen kan ondergaan in reactie op autocrine, paracriene en endocriene factoren; Bloedgedragen bemiddelaars; temperatuur; behandeling met geneesmiddelen; En ziekte ontwikkelenment. Zo is een expressieanalyse gericht op het eiwitgehalte bruikbaar om het proteome te karakteriseren en de kritische veranderingen die erin voorkomen, te ontrafelen als onderdeel van ziektepatogenese 3 .
Daarom zijn de mogelijkheden die proteomics presenteren om de gezondheids- en ziekteomstandigheden te verduidelijken, ondanks de huidige technologische uitdagingen formidabel. De bijzonder veelbelovende onderzoeksgebieden waaraan proteomics kunnen bijdragen, omvat: het identificeren van gewijzigde eiwituitdrukking op elk niveau ( dwz hele cellen of weefsel, subcellulaire compartimenten en biologische vloeistoffen); De identificatie, verificatie en validatie van nieuwe biomarkers die nuttig zijn voor de diagnose en prognose van de ziekte; En hopelijk de identificatie van nieuwe eiwitdoelstellingen die ter therapeutische doeleinden kunnen worden gebruikt, alsmede voor de beoordeling van de werkzaamheid en toxiciteit van geneesmiddelen 4 .
Het vastleggen van de complexiteit vanHet proteome vertegenwoordigt een technologische uitdaging. De huidige proteomische instrumenten bieden de mogelijkheid om op grote schaal analyses uit te voeren voor de identificatie, kwantificering en validatie van gewijzigde eiwitniveaus. Daarnaast heeft de introductie van fractionerings- en verrijkingstechnieken, die gericht zijn op het vermijden van de interferentie veroorzaakt door de meest overvloedige eiwitten, ook verbeterde eiwitidentificatie door de minste overvloedige eiwitten te omvatten. Tenslotte is proteomics aangevuld met de analyse van post-translational modificaties, die zich als belangrijke modulatoren van eiwitfunctie voordoen.
De monstervoorbereiding en het eiwitherstel in de biologische monsters onder analyse blijven echter de beperkende stappen in de proteomische workflow en vergroten het potentieel voor mogelijke valkuilen 5 . Inderdaad, in de meeste moleculaire biologie technieken die moeten worden geoptimaliseerd, zijn de eerste stappen tissue homogenizatIon- en cellysis, in het bijzonder tijdens de analyse van eiwitten met weinig overvloed waarvoor geen amplificatiemethoden bestaan. Bovendien kan de chemische aard van eiwitten hun eigen herstel beïnvloeden. Bijvoorbeeld, de analyse van zeer hydrofobe eiwitten is zeer uitdagend omdat ze gemakkelijk neerslaan tijdens isoelectrische focus, terwijl transmembraan eiwitten bijna onoplosbaar zijn (in Referentie 5 onderzocht). Bovendien vormt de variatie van de weefselsamenstelling een belangrijke barrière voor het ontwikkelen van een universele extractiemethode. Ten slotte, omdat bijna alle klinische exemplaren van beperkte hoeveelheid zijn, is het essentieel om eiwitbereiding mogelijk te maken met maximaal herstel en reproduceerbaarheid van minimale monsterhoeveelheden 6 .
Dit werk beschrijft een geoptimaliseerd protocol voor extractie van eiwitten uit de normale menselijke hart mitralisklep, die een zeer uitdagend monster voor proteomische analyse vertegenwoordigt. De normale mitrale klep is een compLex structuur tussen het linker atrium en de linker hartslag van het hart ( figuur 1 ). Het speelt een belangrijke rol in de controle van de bloedstroom van het atrium naar de ventrikel, het voorkomen van terugstroom en het verzekeren van de juiste zuurstofvoorziening aan het hele lichaam, waardoor een adequate hartuitgang wordt behouden. Het wordt echter vaak beschouwd als een "inactief" weefsel, met een lage cellulariteit en weinig componenten, voornamelijk in de extracellulaire matrix. Dit komt doordat de inwendige valvulaire interstitiële cellen (VIC's) onder normale omstandigheden een stil fenotype met een biosynthese van lage proteïnen 7 voordoen.
Er is echter aangetoond dat in een pathologische toestand het aantal VICs in de spongiosa toeneemt en hun proteïnesynthese geactiveerd wordt, samen met andere functionele en fenotypische veranderingen 8 . Daarom is het niet verwonderlijk dat de minimale gegevens die beschikbaar zijn inDe literatuur richt zich op de analyse van pathologische mitrale kleppen 9 , 10 , waarin het verhoogde aantal geactiveerde VIC's het relatief hoge aantal geïdentificeerde eiwitten kan verklaren.
Ten slotte kan het onderhavige protocol dienen om het begrip van de pathogene mechanismen die verantwoordelijk zijn voor mitrale klepziekten te ontwikkelen door middel van het bestuderen van mitrale klep eiwit componenten. Inderdaad, een beter begrip van de onderliggende pathologische processen kan bijdragen tot het verbeteren van het klinisch beheer van klepziekten, waarvan de huidige indicaties voor interventie grotendeels op hemodynamische overwegingen zijn gebaseerd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een kritische stap van dit protocol is het gebruik van vloeibare stikstof om het monster te bevriezen en het grindersysteem te chillen. Het gebruik van vloeibare stikstof voorkomt biologische afbraak en zorgt voor efficiënte poedering, maar vereist specifieke training voor veilige hantering.
In dit protocol is een grindersysteem aanwezig voor het slijpen van monsters, omdat kleine monsters moeilijk te herstellen zijn van standaard mortel en stamper. In dit geval verspreiden kleine monsters …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het Italiaanse Ministerie van Volksgezondheid steunde deze studie (RC 2013-BIO 15). We bedanken Barbara Micheli voor haar uitstekende technische bijstand.
Materials
| Saline solution | 0.9 % NaCl | ||
| Eurocollins A | SALF | 30874046 | Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins |
| Eurocollins B | SALF | 30874022 | Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins |
| Wisconsin | Bridge life | RM/N 4081 | Balanced organ's transport medium |
| Biohazard vertical flow air | Burdinola | Class A GMP classification | |
| Dewar Flask | Thermo Scientific | Nalgene 4150-1000 | |
| Cryogrinder system | OPS diagnostics | CG 08-01 | Grinder system containing mortars, pestles and screwdriver |
| Stainless steel forceps | |||
| Stainless steel spatula | |||
| Disposable sterile scalpel | Medisafe | MS-10 | |
| Stainless steel scissors | Autoclavable | ||
| Stainless steel picks | Autoclavable | ||
| Disposable sterile drap | Mon&Tex | 3.307.08 | |
| Sterilizing solution with isopropyl alcohol | 70% isopropyl alcohol | ||
| Sterilizing solution with hydrogen peroxide | 6% hydrogen peroxide | ||
| Micropipette, 1 mL, with tips | |||
| 15 mL centrifuge tubes | VWR international | 9278 | |
| 1.7 mL centrifuge tubes | VWR international | PIER90410 | |
| Urea buffer | 8 M urea, 2 M thiourea, 4 % w/v CHAPS, 20 mM Trizma, 55 mM Dithiotreitol | ||
| Urea | Sigma aldrich | U6504-1KG | To be used for Urea buffer |
| Thiourea | Sigma aldrich | T8656 | To be used for Urea buffer |
| CHAPS | Sigma aldrich | C3023-5GR | To be used for Urea buffer |
| Dithiotreitol | Sigma aldrich | D0632-5G | To be used for Urea buffer |
| Syringe 50 mL | PIC | To be used to filter Urea buffer | |
| 0.22 µm filter | Millipore | SLGP033RB | To be used to filter Urea buffer |
| PFTE Pestle, 2 mL | Kartell | 6302 | Part of Potter-Elvehjem homogenizer |
| Borosilicate glass mortar | Kartell | 6102 | Part of Potter-Elvehjem homogenizer |
| Stirrer | VELP scientifica | Stirrer DLH | To be used for homogenization by Potter-Elvehjem |
| Bradford Protein assay | Bio-Rad laboratories | 5000006 | |
| Tube rotator | Pbi International | F205 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Aluminum foil | |||
| Ice | |||
| Polystyrene box | |||
| Dry ice | |||
| Centrifuge | For centrifugation of 1.7 mL centrifuge tubes at 13,000 x g | ||
| Freezer -80°C | |||
| Precision balance | |||
| Autoclave | For sterilization | ||
| Cryogenic gloves for liquid nitrogen | |||
| Gloves | |||
| Professional forced ventilation and natural air convection oven | For sterilization | ||
| Protease inhibitor cocktail | Sigma aldrich | P8340-5ML | 100X solution |
| ProteoExtract Protein Precipitation Kit | Calbiochem | 539180 | |
| RapiGest | Waters | 186001861 | |
| Cytoscape | www.cytoscape.org | version 2.7 | Software platform for Gene Ontology analysis |
| BiNGO | http://apps.cytoscape.org/apps/bingo | version 3.0.3 | Plugin for Gene ontology analysis |
| AlphaB Crystallin/CRYAB Antibody | Novus Biologicals | NBP1-97494 | Mouse monoclonal antibody against CryAB |
| Septin-11 Antibody | Novus Biologicals | NBP1-83824 | Rabbit polyclonal antibody against septin-11 |
| FHL1 Antibody | Novus Biologicals | NBP-188745 | Rabbit polyclonal antibody against FHL-1 |
| Dermatopontin Antibody | Novus Biologicals | NB110-68135 | Rabbit polyclonal antibody against dermatopontin |
| Goat Anti mouse IgG HRP | Sigma aldrich | A4416-0.5ML | Secondary antibody for immunoblotting |
| Goat Anti rabbit IgG HRP | Bio-Rad laboratories | 170-5046 | Secondary antibody for immunoblotting |
Referências
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nat Rev Genet. 13 (4), 227-232 (2012).
- de Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. Global signatures of protein and mRNA expression levels. Mol Biosyst. 5 (12), 1512-1526 (2009).
- Hanash, S. Disease proteomics. Nature. 422 (6928), 226-232 (2003).
- Ahram, M., Petricoin, E. F. Proteomics Discovery of Disease Biomarkers. Biomark Insights. 3, 325-333 (2008).
- Chandramouli, K., Qian, P. Y. Proteomics: challenges, techniques and possibilities to overcome biological sample complexity. Hum Genomics Proteomics. 2009, (2009).
- Singleton, C. Recent advances in bioanalytical sample preparation for LC-MS analysis. Bioanalysis. 4 (9), 1123-1140 (2012).
- Williams, T. H., Jew, J. Y. Is the mitral valve passive flap theory overstated? An active valve is hypothesized. Med Hypotheses. 62 (4), 605-611 (2004).
- Rabkin, E., et al. Activated interstitial myofibroblasts express catabolic enzymes and mediate matrix remodeling in myxomatous heart valves. Circulation. 104 (21), 2525-2532 (2001).
- Martins Cde, O., et al. Distinct mitral valve proteomic profiles in rheumatic heart disease and myxomatous degeneration. Clin Med Insights Cardiol. 8, 79-86 (2014).
- Tan, H. T., et al. Unravelling the proteome of degenerative human mitral valves. Proteomics. 15 (17), 2934-2944 (2015).
- Banfi, C., et al. Proteome of platelets in patients with coronary artery disease. Exp Hematol. 38 (5), 341-350 (2010).
- Banfi, C., et al. Proteomic analysis of human low-density lipoprotein reveals the presence of prenylcysteine lyase, a hydrogen peroxide-generating enzyme. Proteomics. 9 (5), 1344-1352 (2009).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 193 (1), 265-275 (1951).
- Banfi, C., et al. Very low density lipoprotein-mediated signal transduction and plasminogen activator inhibitor type 1 in cultured HepG2 cells. Circ Res. 85 (2), 208-217 (1999).
- Brioschi, M., et al. Normal human mitral valve proteome: A preliminary investigation by gel-based and gel-free proteomic approaches. Electrophoresis. 37 (20), 2633-2643 (2016).
- Brioschi, M., Lento, S., Tremoli, E., Banfi, C. Proteomic analysis of endothelial cell secretome: a means of studying the pleiotropic effects of Hmg-CoA reductase inhibitors. J Proteomics. 78, 346-361 (2013).
- Sun, S., Zhou, J. Y., Yang, W., Zhang, H. Inhibition of protein carbamylation in urea solution using ammonium-containing buffers. Anal Biochem. 446, 76-81 (2014).
- Rabilloud, T., Adessi, C., Giraudel, A., Lunardi, J. Improvement of the solubilization of proteins in two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients. Electrophoresis. 18 (3-4), 307-316 (1997).
- Santoni, V., Molloy, M., Rabilloud, T. Membrane proteins and proteomics: un amour impossible?. Electrophoresis. 21 (6), 1054-1070 (2000).
- Shechter, D., Dormann, H. L., Allis, C. D., Hake, S. B. Extraction, purification and analysis of histones. Nat Protoc. 2 (6), 1445-1457 (2007).
- Fujiki, Y., Hubbard, A. L., Fowler, S., Lazarow, P. B. Isolation of intracellular membranes by means of sodium carbonate treatment: application to endoplasmic reticulum. J Cell Biol. 93 (1), 97-102 (1982).
- Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics. Proteomics. 4 (12), 3665-3685 (2004).
- Mann, M., Kelleher, N. L. Precision proteomics: the case for high resolution and high mass accuracy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18132-18138 (2008).
- Thakur, S. S., et al. Deep and highly sensitive proteome coverage by LC-MS/MS without prefractionation. Mol Cell Proteomics. 10 (8), M110.003699 (2011).
- Loardi, C., et al. Biology of mitral valve prolapse: the harvest is big, but the workers are few. Int J Cardiol. 151 (2), 129-135 (2011).
- Schoen, F. J. Evolving concepts of cardiac valve dynamics: the continuum of development, functional structure, pathobiology, and tissue engineering. Circulation. 118 (18), 1864-1880 (2008).
- Lelovas, P. P., Kostomitsopoulos, N. G., Xanthos, T. T. A comparative anatomic and physiologic overview of the porcine heart. J Am Assoc Lab Anim Sci. 53 (5), 432-438 (2014).
