Оптимизированный протокол для извлечения белков из митрального клапана человека
Summary
Белковый состав митрального клапана человека все еще частично неизвестен, поскольку его анализ осложняется низкой клеточностью и, следовательно, низким биосинтезом белка. Эта работа обеспечивает протокол для эффективного извлечения белка для анализа протеома митрального клапана.
Abstract
Анализ клеточного протеома может помочь выявить молекулярные механизмы, лежащие в основе болезней, из-за развития технологий, которые позволяют широкомасштабную идентификацию и количественную оценку белков, присутствующих в сложных биологических системах. Знания, полученные из протеомического подхода, могут потенциально привести к Лучшее понимание патогенных механизмов, лежащих в основе болезней, позволяющих идентифицировать новые диагностические и прогностические маркеры болезни и, надеюсь, терапевтических целей. Однако сердечный митральный клапан представляет собой очень сложный образец для протеомического анализа из-за низкой клеточности в протеогликане и обогащенном коллагеном внеклеточном матриксе. Это затрудняет извлечение белков для глобального протеомического анализа. Эта работа описывает протокол, который совместим с последующим анализом белка, таким как количественная протеомика и иммуноблоттинг. Это может обеспечить корреляцию данных вГ белка с данными о количественной экспрессии мРНК и не количественном иммуногистохимическом анализе. Действительно, эти подходы, когда они выполняются вместе, приведут к более полному пониманию молекулярных механизмов, лежащих в основе болезней, от мРНК до посттрансляционной модификации белка. Таким образом, этот метод может иметь отношение к исследователям, заинтересованным в изучении физиопатологии сердечного клапана.
Introduction
Недавние данные изменили понимание роли многих регуляторных механизмов, которые возникают после синтеза мРНК. Действительно, трансляционные, посттранскрипционные и протеолитические процессы могут регулировать количество и функцию белка. Догма – в которой говорится, что концентрации мРНК являются проксимидами, соответствующими концентрациям соответствующих белков, предполагая, что уровни транскрипции являются основным фактором, определяющим количество белков, – были частично пересмотрены. В результате уровни транскрипции лишь частично предсказывают обилие белка, предполагая, что посттранскрипционные события Происходят для регулирования белков в клетках 1 , 2 .
Кроме того, белки в конечном счете диктуют функцию клетки и, следовательно, диктуют ее фенотип, который может подвергаться динамическим изменениям в ответ на аутокринную, паракринную и эндокринную факторы; Кровные посредники; температура; Лечение наркозависимости; И болезни развиваютсяМент. Таким образом, анализ экспрессии, сфокусированный на уровне белка, полезен для характеристики протеома и разгадать критические изменения, которые происходят с ним как часть патогенеза болезни 3 .
Таким образом, возможности, которые протеомика представляет для выяснения состояния здоровья и болезней, являются грозными, несмотря на существующие технологические проблемы. Особенно перспективные области исследований, к которым могут вносить протеомики: идентификация измененной экспрессии белка на любом уровне ( т . Е. Целые клетки или ткань, субклеточные клетки и биологические жидкости); Идентификация, верификация и валидация новых биомаркеров, полезных для диагностики и прогнозирования болезни; И, мы надеемся, идентификация новых белковых мишеней, которые могут быть использованы в терапевтических целях, а также для оценки эффективности и токсичности препарата 4 .
Захват сложностиПротеом представляет собой технологическую проблему. Существующие протеомические инструменты дают возможность проводить крупномасштабный высокопроизводительный анализ для идентификации, количественной оценки и проверки измененных уровней белка. Кроме того, внедрение методов фракционирования и обогащения, направленных на предотвращение интерференции, вызванной наиболее распространенными белками, также улучшило идентификацию белка путем включения наименее распространенных белков. Наконец, протеомика дополнена анализом посттрансляционных модификаций, которые постепенно появляются как важные модуляторы функции белка.
Однако подготовка проб и восстановление белка в анализируемых биологических образцах по-прежнему остаются предельными стадиями протеомического рабочего процесса и увеличивают потенциал возможных ловушек 5 . Действительно, в большинстве методов молекулярной биологии, которые необходимо оптимизировать, первыми шагами являются гомогенизация тканиИон и клеточный лизис, особенно при анализе белков с низким уровнем обилия, для которых методов амплификации не существует. Кроме того, химическая природа белков может влиять на их собственное выздоровление. Например, анализ высокогидрофобных белков очень сложный, поскольку они легко осаждаются во время изоэлектрической фокусировки, тогда как транс-мембранные белки почти нерастворимы (см. Ссылку 5). Кроме того, изменчивость состава ткани создает значительный барьер для разработки универсального метода экстракции. Наконец, поскольку почти все клинические образцы имеют ограниченное количество, необходимо обеспечить подготовку белка с максимальным восстановлением и воспроизводимостью из минимальных количеств проб 6 .
В этой работе описывается оптимизированный протокол экстракции белка из нормального митрального клапана сердца человека, который представляет собой очень сложный образец для протеомического анализа. Нормальный митральный клапан представляет собой компLex, лежащей между левым предсердием и левым желудочком сердца ( рис. 1 ). Он играет важную роль в контроле кровотока из атриума в желудочек, предотвращении обратного потока и обеспечении надлежащего уровня подачи кислорода всему телу, что обеспечивает адекватный сердечный выброс. Однако он часто считается «неактивной» тканью с низкой клеточностью и несколькими компонентами, главным образом в внеклеточной матрице. Это связано с тем, что в нормальных условиях резидентные клапанные интерстициальные клетки (VIC) представляют собой покоящийся фенотип с низкой скоростью биосинтеза белка 7 .
Однако было продемонстрировано, что в патологическом состоянии количество VIC в спонгиозе увеличивается, а их синтез белка активируется вместе с другими функциональными и фенотипическими изменениями 8 . Поэтому неудивительно, что минимальные данные, имеющиеся вВ литературе основное внимание уделяется анализу патологических митральных клапанов 9 , 10 , в которых увеличение числа активированных ВИП может объяснить относительно большое количество идентифицированных белков.
В заключение, настоящий протокол может служить для развития понимания патогенных механизмов, ответственных за болезни митрального клапана, путем изучения компонентов белка митрального клапана. Действительно, более глубокое понимание лежащих в основе патологических процессов могло бы помочь улучшить клиническое лечение клапанных заболеваний, чьи текущие показания к вмешательству в основном основаны на гемодинамических соображениях.
Protocol
Representative Results
Discussion
Одним из важных шагов этого протокола является использование жидкого азота для замораживания образца и охлаждения системы измельчителя. Использование жидкого азота предотвращает биологическую деградацию и позволяет эффективно напылять, но требует специальной подготовки для безоп?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Министерство здравоохранения Италии поддержало это исследование (RC 2013-BIO 15). Мы благодарим Барбару Мишели за ее отличную техническую помощь.
Materials
| Saline solution | 0.9 % NaCl | ||
| Eurocollins A | SALF | 30874046 | Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins |
| Eurocollins B | SALF | 30874022 | Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins |
| Wisconsin | Bridge life | RM/N 4081 | Balanced organ's transport medium |
| Biohazard vertical flow air | Burdinola | Class A GMP classification | |
| Dewar Flask | Thermo Scientific | Nalgene 4150-1000 | |
| Cryogrinder system | OPS diagnostics | CG 08-01 | Grinder system containing mortars, pestles and screwdriver |
| Stainless steel forceps | |||
| Stainless steel spatula | |||
| Disposable sterile scalpel | Medisafe | MS-10 | |
| Stainless steel scissors | Autoclavable | ||
| Stainless steel picks | Autoclavable | ||
| Disposable sterile drap | Mon&Tex | 3.307.08 | |
| Sterilizing solution with isopropyl alcohol | 70% isopropyl alcohol | ||
| Sterilizing solution with hydrogen peroxide | 6% hydrogen peroxide | ||
| Micropipette, 1 mL, with tips | |||
| 15 mL centrifuge tubes | VWR international | 9278 | |
| 1.7 mL centrifuge tubes | VWR international | PIER90410 | |
| Urea buffer | 8 M urea, 2 M thiourea, 4 % w/v CHAPS, 20 mM Trizma, 55 mM Dithiotreitol | ||
| Urea | Sigma aldrich | U6504-1KG | To be used for Urea buffer |
| Thiourea | Sigma aldrich | T8656 | To be used for Urea buffer |
| CHAPS | Sigma aldrich | C3023-5GR | To be used for Urea buffer |
| Dithiotreitol | Sigma aldrich | D0632-5G | To be used for Urea buffer |
| Syringe 50 mL | PIC | To be used to filter Urea buffer | |
| 0.22 µm filter | Millipore | SLGP033RB | To be used to filter Urea buffer |
| PFTE Pestle, 2 mL | Kartell | 6302 | Part of Potter-Elvehjem homogenizer |
| Borosilicate glass mortar | Kartell | 6102 | Part of Potter-Elvehjem homogenizer |
| Stirrer | VELP scientifica | Stirrer DLH | To be used for homogenization by Potter-Elvehjem |
| Bradford Protein assay | Bio-Rad laboratories | 5000006 | |
| Tube rotator | Pbi International | F205 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Aluminum foil | |||
| Ice | |||
| Polystyrene box | |||
| Dry ice | |||
| Centrifuge | For centrifugation of 1.7 mL centrifuge tubes at 13,000 x g | ||
| Freezer -80°C | |||
| Precision balance | |||
| Autoclave | For sterilization | ||
| Cryogenic gloves for liquid nitrogen | |||
| Gloves | |||
| Professional forced ventilation and natural air convection oven | For sterilization | ||
| Protease inhibitor cocktail | Sigma aldrich | P8340-5ML | 100X solution |
| ProteoExtract Protein Precipitation Kit | Calbiochem | 539180 | |
| RapiGest | Waters | 186001861 | |
| Cytoscape | www.cytoscape.org | version 2.7 | Software platform for Gene Ontology analysis |
| BiNGO | http://apps.cytoscape.org/apps/bingo | version 3.0.3 | Plugin for Gene ontology analysis |
| AlphaB Crystallin/CRYAB Antibody | Novus Biologicals | NBP1-97494 | Mouse monoclonal antibody against CryAB |
| Septin-11 Antibody | Novus Biologicals | NBP1-83824 | Rabbit polyclonal antibody against septin-11 |
| FHL1 Antibody | Novus Biologicals | NBP-188745 | Rabbit polyclonal antibody against FHL-1 |
| Dermatopontin Antibody | Novus Biologicals | NB110-68135 | Rabbit polyclonal antibody against dermatopontin |
| Goat Anti mouse IgG HRP | Sigma aldrich | A4416-0.5ML | Secondary antibody for immunoblotting |
| Goat Anti rabbit IgG HRP | Bio-Rad laboratories | 170-5046 | Secondary antibody for immunoblotting |
Referências
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nat Rev Genet. 13 (4), 227-232 (2012).
- de Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. Global signatures of protein and mRNA expression levels. Mol Biosyst. 5 (12), 1512-1526 (2009).
- Hanash, S. Disease proteomics. Nature. 422 (6928), 226-232 (2003).
- Ahram, M., Petricoin, E. F. Proteomics Discovery of Disease Biomarkers. Biomark Insights. 3, 325-333 (2008).
- Chandramouli, K., Qian, P. Y. Proteomics: challenges, techniques and possibilities to overcome biological sample complexity. Hum Genomics Proteomics. 2009, (2009).
- Singleton, C. Recent advances in bioanalytical sample preparation for LC-MS analysis. Bioanalysis. 4 (9), 1123-1140 (2012).
- Williams, T. H., Jew, J. Y. Is the mitral valve passive flap theory overstated? An active valve is hypothesized. Med Hypotheses. 62 (4), 605-611 (2004).
- Rabkin, E., et al. Activated interstitial myofibroblasts express catabolic enzymes and mediate matrix remodeling in myxomatous heart valves. Circulation. 104 (21), 2525-2532 (2001).
- Martins Cde, O., et al. Distinct mitral valve proteomic profiles in rheumatic heart disease and myxomatous degeneration. Clin Med Insights Cardiol. 8, 79-86 (2014).
- Tan, H. T., et al. Unravelling the proteome of degenerative human mitral valves. Proteomics. 15 (17), 2934-2944 (2015).
- Banfi, C., et al. Proteome of platelets in patients with coronary artery disease. Exp Hematol. 38 (5), 341-350 (2010).
- Banfi, C., et al. Proteomic analysis of human low-density lipoprotein reveals the presence of prenylcysteine lyase, a hydrogen peroxide-generating enzyme. Proteomics. 9 (5), 1344-1352 (2009).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 193 (1), 265-275 (1951).
- Banfi, C., et al. Very low density lipoprotein-mediated signal transduction and plasminogen activator inhibitor type 1 in cultured HepG2 cells. Circ Res. 85 (2), 208-217 (1999).
- Brioschi, M., et al. Normal human mitral valve proteome: A preliminary investigation by gel-based and gel-free proteomic approaches. Electrophoresis. 37 (20), 2633-2643 (2016).
- Brioschi, M., Lento, S., Tremoli, E., Banfi, C. Proteomic analysis of endothelial cell secretome: a means of studying the pleiotropic effects of Hmg-CoA reductase inhibitors. J Proteomics. 78, 346-361 (2013).
- Sun, S., Zhou, J. Y., Yang, W., Zhang, H. Inhibition of protein carbamylation in urea solution using ammonium-containing buffers. Anal Biochem. 446, 76-81 (2014).
- Rabilloud, T., Adessi, C., Giraudel, A., Lunardi, J. Improvement of the solubilization of proteins in two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients. Electrophoresis. 18 (3-4), 307-316 (1997).
- Santoni, V., Molloy, M., Rabilloud, T. Membrane proteins and proteomics: un amour impossible?. Electrophoresis. 21 (6), 1054-1070 (2000).
- Shechter, D., Dormann, H. L., Allis, C. D., Hake, S. B. Extraction, purification and analysis of histones. Nat Protoc. 2 (6), 1445-1457 (2007).
- Fujiki, Y., Hubbard, A. L., Fowler, S., Lazarow, P. B. Isolation of intracellular membranes by means of sodium carbonate treatment: application to endoplasmic reticulum. J Cell Biol. 93 (1), 97-102 (1982).
- Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics. Proteomics. 4 (12), 3665-3685 (2004).
- Mann, M., Kelleher, N. L. Precision proteomics: the case for high resolution and high mass accuracy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18132-18138 (2008).
- Thakur, S. S., et al. Deep and highly sensitive proteome coverage by LC-MS/MS without prefractionation. Mol Cell Proteomics. 10 (8), M110.003699 (2011).
- Loardi, C., et al. Biology of mitral valve prolapse: the harvest is big, but the workers are few. Int J Cardiol. 151 (2), 129-135 (2011).
- Schoen, F. J. Evolving concepts of cardiac valve dynamics: the continuum of development, functional structure, pathobiology, and tissue engineering. Circulation. 118 (18), 1864-1880 (2008).
- Lelovas, P. P., Kostomitsopoulos, N. G., Xanthos, T. T. A comparative anatomic and physiologic overview of the porcine heart. J Am Assoc Lab Anim Sci. 53 (5), 432-438 (2014).
