פרוטוקול אופטימיזציה עבור הפקת חלבונים מן שסתום מיטרלי האדם
Summary
הרכב החלבון של שסתום המיטרל האנושי עדיין לא ידוע חלקית, משום שהניתוח שלו מסובך על ידי תאימות נמוכה ולכן על ידי ביוסינתזה חלבונית נמוכה. עבודה זו מספקת פרוטוקול ביעילות לחלץ חלבון לניתוח של proteome שסתום מיטרלי.
Abstract
ניתוח של proteome הסלולר יכול לעזור להבהיר את המנגנונים המולקולריים שבבסיס מחלות עקב פיתוח של טכנולוגיות המאפשרים זיהוי בקנה מידה גדול וכימות של חלבונים הנוכחי במערכות ביולוגיות מורכבות.ידע שנרכש מתוך גישה proteomic יכול להוביל הבנה טובה יותר של המנגנונים הפתוגניים המונחים ביסוד מחלות, ומאפשרת זיהוי של סמני מחלה אבחנתיים ופרוגנוסטיים חדשים, וכן, בתקווה, של מטרות טיפוליות. עם זאת, שסתום מיטרלי הלב מייצג מדגם מאתגר מאוד עבור ניתוח proteomic בגלל הסלולר נמוכה ב proteoglycan ו קולגן מועשר תאיים מטריקס. זה עושה את זה מאתגר לחלץ חלבונים לניתוח proteomic העולמי. עבודה זו מתארת פרוטוקול התואם ניתוח חלבון לאחר מכן, כגון proteomics כמותי immunoblotting. זה יכול לאפשר את המתאם של נתונים דאגהG ביטוי חלבון עם נתונים על ביטוי mRNA כמותי ניתוח כמותי אימונוהיסטוכימיים. ואכן, גישות אלה, כאשר ביצע יחד, יוביל להבנה מקיפה יותר של המנגנונים המולקולריים שבבסיס מחלות, מ mRNA כדי שינוי שלאחר החלבון translational. לכן, שיטה זו יכולה להיות רלוונטית לחוקרים המעוניינים במחקר physiopathology שסתום הלב.
Introduction
עדויות האחרונות שינו את ההבנה של התפקידים של מנגנונים רגולטוריים רבים המתרחשים לאחר סינתזת mRNA. ואכן, תהליכים טרנסלציוניים, פוסט-תעתיקיים ופרוטוליטיים יכולים להסדיר את שפע החלבון ולתפקודו. הדוגמה – שאומרת כי ריכוזי ה- mRNA הם פרוקסי לאלה של החלבונים המתאימים, בהנחה שרמות התמלילים הן הגורם העיקרי לשפע החלבון – תוקנו חלקית. למרות זאת, רמות התמליל רק מנבאות באופן חלקי את כמות החלבון, מה שמרמז על אירועים פוסט-תעתיק להתרחש כדי לווסת את החלבונים בתוך תאים 1 , 2 .
יתר על כן, חלבונים בסופו של דבר להכתיב את הפונקציה של התא ולכן להכתיב פנוטיפ שלה, אשר יכול לעבור שינויים דינמיים בתגובה גורמים אוטוקרינית, פאראקרין, אנדוקרינית; מתווכים עם דם; טֶמפֶּרָטוּרָה; טיפול תרופתי; ואת המחלה לפתחמנט. לפיכך, ניתוח הביטוי התמקדו ברמת החלבון הוא שימושי כדי לאפיין את proteome ולפרם את השינויים הקריטיים המתרחשים אליו כחלק מחולי המחלה 3 .
לכן, את ההזדמנויות כי proteomics הנוכחי כדי להבהיר בריאות ומחלות התנאים הם אדירים, למרות האתגרים הטכנולוגיים הקיימים. התחומים המבטיחים במיוחד של מחקר, שבהם יכולים פרוטאומיסטים לתרום: זיהוי של ביטוי חלבון שונה בכל רמה ( כלומר, תאים שלמים או רקמות, תאים תת-תאיים ונוזלים ביולוגיים); זיהוי, אימות ואימות של סמנים ביולוגיים חדשים המשמשים לאבחון ולפרוגנוזה של מחלות; וכן, בתקווה, זיהוי של מטרות חלבון חדש שניתן להשתמש בהם למטרות טיפוליות, כמו גם להערכת יעילות התרופות ואת הרעילות 4 .
לכידת המורכבות שלהפרוטאום מייצג אתגר טכנולוגי. כלים proteomic הנוכחי מציעים את ההזדמנות לבצע בקנה מידה גדול, תפוקה גבוהה ניתוח עבור זיהוי, כימות, ואימות של רמות חלבון השתנה. בנוסף, הכנסת שיטות חלוקה והעשרה, שמטרתן למנוע את ההפרעה הנגרמת על ידי החלבונים השופעים ביותר, שיפרה גם את זיהוי החלבון על ידי הכללת החלבונים הפחות שופעים. לבסוף, proteomics הושלמה על ידי ניתוח של שינויים לאחר translational, אשר בהדרגה מופיעים כמו מאפננים חשובים של תפקוד החלבון.
עם זאת, ההכנה המדגם התאוששות חלבון בדגימות ביולוגי תחת ניתוח עדיין להישאר הגבלת הצעדים של זרימת העבודה proteomic ולהגדיל את הפוטנציאל האפשרי pitfalls 5 . ואכן, ברוב טכניקות ביולוגיה מולקולרית כי חייב להיות מותאם, הצעדים הראשונים הם homogenizat רקמותיון ותאי תא, במיוחד במהלך ניתוח של חלבונים בשפע נמוכה עבורם שיטות הגברה לא קיימים. בנוסף, הטבע הכימי של חלבונים יכול להשפיע על ההתאוששות שלהם. לדוגמה, ניתוח של חלבונים הידרופובי מאוד הוא מאתגר מאוד, כי הם מזרזים בקלות במהלך ההתמקדות isoelectric, בעוד חלבונים ממברנה טרנס הם כמעט בלתי מסיסים (נסקרת ב הפניה 5). יתר על כן, השתנות הרכב הרקמה יוצרת מחסום משמעותי לפיתוח שיטת החילוץ האוניברסלית. לבסוף, כי כמעט כל הדגימות הקליניות הן של כמות מוגבלת, זה חיוני כדי לאפשר הכנת חלבון עם התאוששות מקסימלית reproducibility מ כמויות מדגם מינימלי 6 .
עבודה זו מתארת פרוטוקול אופטימיזציה עבור החילוץ חלבון מן השסתום המיטרלי של הלב האנושי, המייצג מדגם מאתגר מאוד עבור ניתוח proteomic. שסתום מיטרלי רגיל הוא compמבנה lx שוכב בין אטריום שמאל החדר השמאלי של הלב ( איור 1 ). זה משחק תפקיד חשוב בשליטה על זרימת הדם מן אטריום החדר, מניעת backflow ולהבטיח את רמת נאותה של אספקת חמצן לכל הגוף, ובכך לשמור על פלט לב נאותה. עם זאת, הוא נחשב לעתים קרובות רקמה "לא פעילה", עם תאיות נמוכה כמה רכיבים, בעיקר מטריקס תאיים. הסיבה לכך היא, בתנאים נורמליים, התאים intervitial valvular תושב (VICs) להציג פנוטיפ שקט עם שיעור נמוך biosynthesis חלבון 7 .
עם זאת, הוכח כי במצב פתולוגי, מספר VICs ב spongiosa עולה סינתזת החלבון שלהם מופעל, יחד עם שינויים פונקציונליים אחרים פנוטיפי 8 . לכן, אין זה מפתיע כי הנתונים המינימליים הזמיניםהספרות מתמקדת בניתוח של שסתומים מיטרליים פתולוגיים 9 , 10 , שבהם מספר מוגבר של VICs מופעל עשוי להסביר את המספר הגבוה יחסית של חלבונים מזוהים.
לסיכום, פרוטוקול זה עשוי לשמש כדי להבין את ההבנה של מנגנונים פתוגניים האחראים על מחלות שסתום מיטרלי באמצעות מחקר של מרכיבי חלבון מיטרלי שסתום. ואכן, הבנה גדולה יותר של התהליכים הפתולוגיים הבסיסיים יכולה לסייע בשיפור הניהול הקליני של מחלות שסתום, אשר האינדיקציות הנוכחיות שלהם להתערבות מבוססות במידה רבה על שיקולים המודינאמיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
צעד קריטי אחד של פרוטוקול זה הוא השימוש של חנקן נוזלי להקפיא את המדגם כדי לצנן את מערכת המטחנה. השימוש בחנקן נוזלי מונע השפלה ביולוגית ומאפשר אבקה יעילה, אבל זה דורש הכשרה ספציפית לטיפול בטוח.
בפרוטוקול זה תכונות מערכת המטחנה עבו?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
משרד הבריאות האיטלקי תמך במחקר זה (RC 2013-BIO 15). אנו מודים לברברה מישלי על עזרתה הטכנית המצוינת.
Materials
| Saline solution | 0.9 % NaCl | ||
| Eurocollins A | SALF | 30874046 | Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins |
| Eurocollins B | SALF | 30874022 | Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins |
| Wisconsin | Bridge life | RM/N 4081 | Balanced organ's transport medium |
| Biohazard vertical flow air | Burdinola | Class A GMP classification | |
| Dewar Flask | Thermo Scientific | Nalgene 4150-1000 | |
| Cryogrinder system | OPS diagnostics | CG 08-01 | Grinder system containing mortars, pestles and screwdriver |
| Stainless steel forceps | |||
| Stainless steel spatula | |||
| Disposable sterile scalpel | Medisafe | MS-10 | |
| Stainless steel scissors | Autoclavable | ||
| Stainless steel picks | Autoclavable | ||
| Disposable sterile drap | Mon&Tex | 3.307.08 | |
| Sterilizing solution with isopropyl alcohol | 70% isopropyl alcohol | ||
| Sterilizing solution with hydrogen peroxide | 6% hydrogen peroxide | ||
| Micropipette, 1 mL, with tips | |||
| 15 mL centrifuge tubes | VWR international | 9278 | |
| 1.7 mL centrifuge tubes | VWR international | PIER90410 | |
| Urea buffer | 8 M urea, 2 M thiourea, 4 % w/v CHAPS, 20 mM Trizma, 55 mM Dithiotreitol | ||
| Urea | Sigma aldrich | U6504-1KG | To be used for Urea buffer |
| Thiourea | Sigma aldrich | T8656 | To be used for Urea buffer |
| CHAPS | Sigma aldrich | C3023-5GR | To be used for Urea buffer |
| Dithiotreitol | Sigma aldrich | D0632-5G | To be used for Urea buffer |
| Syringe 50 mL | PIC | To be used to filter Urea buffer | |
| 0.22 µm filter | Millipore | SLGP033RB | To be used to filter Urea buffer |
| PFTE Pestle, 2 mL | Kartell | 6302 | Part of Potter-Elvehjem homogenizer |
| Borosilicate glass mortar | Kartell | 6102 | Part of Potter-Elvehjem homogenizer |
| Stirrer | VELP scientifica | Stirrer DLH | To be used for homogenization by Potter-Elvehjem |
| Bradford Protein assay | Bio-Rad laboratories | 5000006 | |
| Tube rotator | Pbi International | F205 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Aluminum foil | |||
| Ice | |||
| Polystyrene box | |||
| Dry ice | |||
| Centrifuge | For centrifugation of 1.7 mL centrifuge tubes at 13,000 x g | ||
| Freezer -80°C | |||
| Precision balance | |||
| Autoclave | For sterilization | ||
| Cryogenic gloves for liquid nitrogen | |||
| Gloves | |||
| Professional forced ventilation and natural air convection oven | For sterilization | ||
| Protease inhibitor cocktail | Sigma aldrich | P8340-5ML | 100X solution |
| ProteoExtract Protein Precipitation Kit | Calbiochem | 539180 | |
| RapiGest | Waters | 186001861 | |
| Cytoscape | www.cytoscape.org | version 2.7 | Software platform for Gene Ontology analysis |
| BiNGO | http://apps.cytoscape.org/apps/bingo | version 3.0.3 | Plugin for Gene ontology analysis |
| AlphaB Crystallin/CRYAB Antibody | Novus Biologicals | NBP1-97494 | Mouse monoclonal antibody against CryAB |
| Septin-11 Antibody | Novus Biologicals | NBP1-83824 | Rabbit polyclonal antibody against septin-11 |
| FHL1 Antibody | Novus Biologicals | NBP-188745 | Rabbit polyclonal antibody against FHL-1 |
| Dermatopontin Antibody | Novus Biologicals | NB110-68135 | Rabbit polyclonal antibody against dermatopontin |
| Goat Anti mouse IgG HRP | Sigma aldrich | A4416-0.5ML | Secondary antibody for immunoblotting |
| Goat Anti rabbit IgG HRP | Bio-Rad laboratories | 170-5046 | Secondary antibody for immunoblotting |
Referências
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nat Rev Genet. 13 (4), 227-232 (2012).
- de Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. Global signatures of protein and mRNA expression levels. Mol Biosyst. 5 (12), 1512-1526 (2009).
- Hanash, S. Disease proteomics. Nature. 422 (6928), 226-232 (2003).
- Ahram, M., Petricoin, E. F. Proteomics Discovery of Disease Biomarkers. Biomark Insights. 3, 325-333 (2008).
- Chandramouli, K., Qian, P. Y. Proteomics: challenges, techniques and possibilities to overcome biological sample complexity. Hum Genomics Proteomics. 2009, (2009).
- Singleton, C. Recent advances in bioanalytical sample preparation for LC-MS analysis. Bioanalysis. 4 (9), 1123-1140 (2012).
- Williams, T. H., Jew, J. Y. Is the mitral valve passive flap theory overstated? An active valve is hypothesized. Med Hypotheses. 62 (4), 605-611 (2004).
- Rabkin, E., et al. Activated interstitial myofibroblasts express catabolic enzymes and mediate matrix remodeling in myxomatous heart valves. Circulation. 104 (21), 2525-2532 (2001).
- Martins Cde, O., et al. Distinct mitral valve proteomic profiles in rheumatic heart disease and myxomatous degeneration. Clin Med Insights Cardiol. 8, 79-86 (2014).
- Tan, H. T., et al. Unravelling the proteome of degenerative human mitral valves. Proteomics. 15 (17), 2934-2944 (2015).
- Banfi, C., et al. Proteome of platelets in patients with coronary artery disease. Exp Hematol. 38 (5), 341-350 (2010).
- Banfi, C., et al. Proteomic analysis of human low-density lipoprotein reveals the presence of prenylcysteine lyase, a hydrogen peroxide-generating enzyme. Proteomics. 9 (5), 1344-1352 (2009).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 193 (1), 265-275 (1951).
- Banfi, C., et al. Very low density lipoprotein-mediated signal transduction and plasminogen activator inhibitor type 1 in cultured HepG2 cells. Circ Res. 85 (2), 208-217 (1999).
- Brioschi, M., et al. Normal human mitral valve proteome: A preliminary investigation by gel-based and gel-free proteomic approaches. Electrophoresis. 37 (20), 2633-2643 (2016).
- Brioschi, M., Lento, S., Tremoli, E., Banfi, C. Proteomic analysis of endothelial cell secretome: a means of studying the pleiotropic effects of Hmg-CoA reductase inhibitors. J Proteomics. 78, 346-361 (2013).
- Sun, S., Zhou, J. Y., Yang, W., Zhang, H. Inhibition of protein carbamylation in urea solution using ammonium-containing buffers. Anal Biochem. 446, 76-81 (2014).
- Rabilloud, T., Adessi, C., Giraudel, A., Lunardi, J. Improvement of the solubilization of proteins in two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients. Electrophoresis. 18 (3-4), 307-316 (1997).
- Santoni, V., Molloy, M., Rabilloud, T. Membrane proteins and proteomics: un amour impossible?. Electrophoresis. 21 (6), 1054-1070 (2000).
- Shechter, D., Dormann, H. L., Allis, C. D., Hake, S. B. Extraction, purification and analysis of histones. Nat Protoc. 2 (6), 1445-1457 (2007).
- Fujiki, Y., Hubbard, A. L., Fowler, S., Lazarow, P. B. Isolation of intracellular membranes by means of sodium carbonate treatment: application to endoplasmic reticulum. J Cell Biol. 93 (1), 97-102 (1982).
- Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics. Proteomics. 4 (12), 3665-3685 (2004).
- Mann, M., Kelleher, N. L. Precision proteomics: the case for high resolution and high mass accuracy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18132-18138 (2008).
- Thakur, S. S., et al. Deep and highly sensitive proteome coverage by LC-MS/MS without prefractionation. Mol Cell Proteomics. 10 (8), M110.003699 (2011).
- Loardi, C., et al. Biology of mitral valve prolapse: the harvest is big, but the workers are few. Int J Cardiol. 151 (2), 129-135 (2011).
- Schoen, F. J. Evolving concepts of cardiac valve dynamics: the continuum of development, functional structure, pathobiology, and tissue engineering. Circulation. 118 (18), 1864-1880 (2008).
- Lelovas, P. P., Kostomitsopoulos, N. G., Xanthos, T. T. A comparative anatomic and physiologic overview of the porcine heart. J Am Assoc Lab Anim Sci. 53 (5), 432-438 (2014).
