Summary
Ce protocole permet la microscopie à une seule cellule des cellules Swimmer et Swarmer Vibrio parahaemolyticus différentiellement distinctes. La méthode produit une population de cellules moustiques facilement disponibles pour une analyse cellulaire unique et couvre la préparation de cultures cellulaires, l'induction de la différenciation des mollusques, la préparation des échantillons et l'analyse d'image.
Abstract
La capacité d'étudier la localisation intracellulaire des protéines est essentielle pour la compréhension de nombreux processus cellulaires. À son tour, cela nécessite la possibilité d'obtenir des cellules individuelles pour la microscopie de fluorescence, ce qui peut être particulièrement difficile lors de l'imagerie des cellules qui existent dans les communautés bactériennes. Par exemple, le pathogène humain Vibrio parahaemolyticus existe comme de petites cellules nageuses en forme de tige dans des conditions liquides qui, lors du contact de surface, se différencient en une sous-population de cellules de bourgeons fortement allongées spécialisées dans la croissance sur des surfaces solides. Cet article présente une méthode pour effectuer une analyse de microscopie de fluorescence à une seule cellule de V. parahaemolyticus dans ses deux états différentiels. Ce protocole induit de manière très reproductible la différenciation de V. parahaemolyticus dans un cycle de vie de la cellule gonflante et facilite leur prolifération sur les surfaces solides. La méthode produit des étincelles de cellules de bourgeons différenciées s'étendant de tIl se dirigea vers la colonie d'essaims. Notamment, à la pointe même des évasements d'essaim, les cellules de mollusque existent dans une seule couche de cellules, ce qui permet leur transfert facile vers une lame de microscope et une microscopie à fluorescence ultérieure d'une seule cellule. En outre, le flux de travail de l'analyse d'image pour la représentation démographique des sociétés bactériennes est présenté. En tant que preuve de principe, on décrit l'analyse de la localisation intracellulaire des réseaux de signalisation chimiotaxique dans les cellules nageuses et moustiques de V. parahaemolyticus.
Introduction
Les bactéries connaissent constamment des changements dans leur environnement externe et ont développé plusieurs techniques pour modifier et adapter leurs comportements en conséquence. Un tel mécanisme implique une différenciation en types de cellules distinctes qui complètent mieux l'environnement altéré. La différenciation implique souvent des changements majeurs dans la régulation du cycle cellulaire, de la morphologie cellulaire et de l'organisation spatio-temporelle des cellules. Un organisme qui peut subir une différenciation est Vibrio parahaemolyticus . V. parahaemolyticus appartient aux Vibrionaceae , qui est une famille de protéobactéries qui habitent habituellement des eaux fraîches ou salées. Les vibrionaceae sont largement distribués dans l'environnement et comprennent plusieurs espèces qui causent des infections intestinales chez les humains, y compris le Vibrio cholerae.V. Parahaemolyticus est un organisme dimorphique et peut se différencier en deux types cellulaires distincts en réponse à des changementsMilieu externe. Dans les environnements aqueux, il existe comme une petite cellule nageuse en forme de tige avec un seul flagelle polaire positionné à l'ancien pôle cellulaire. Lors du contact de surface, la différenciation dans une cellule de nerf est déclenchée. La différenciation cellulaire de Swarmer implique deux changements majeurs: la morphogenèse des cellules moustiques par l'inhibition de la division cellulaire et l'induction d'un deuxième système de flagelles. Il en résulte la formation d'une cellule de bourgeons peritrichous et hautement allongée, qui peut soit continuer le style de vie des mollusques, où les événements de division donnent naissance à des cellules moustiques de descendance, soit différencier de nouveau dans des cellules nageuses.
Plusieurs facteurs ont été rapportés pour induire ou influencer la différenciation des mollusques. Le stimulus primaire semble être conduit par des mechanosensing où V. parahaemolyticus utilise le flagelle polaire comme capteur tactile qui détecte l'inhibition de la rotation lors du contact de surface, mais plusieurs autres facteurs sont impliqués commeBien 1 . En laboratoire, la rotation du flagelle polaire peut être inhibée artificiellement par addition de phénamil, ce qui bloque la rotation flagellaire entraînée par le canal de sodium, induisant ainsi une différenciation des fléaux 2 . En outre, dans une étude antérieure , Vibrio alginolyticus a été induit à emmêler sur des milieux solides lorsque les cellules ont été propagées sur un milieu de croissance dans une boîte de Petri scellée avec un ruban adhésif transparent. Le papier filtre saturé alcalin a empêché de grouiller dans ces conditions, ce qui suggère qu'un ou plusieurs acides volatils pourraient être impliqués dans l'induction de l'essaimage. Ainsi, l'étanchéité de la boîte de Petri avec un ruban plastique permettait vraisemblablement l'accumulation d'acides volatils, formés comme sous-produits du métabolisme cellulaire, dans l'espace de tête de la plaque. Le même effet a été obtenu lorsque le H 2 O 2 a été ajouté au milieu de croissance dans des boîtes de Petri non scellées afin de produire artificiellement des acides volatils en hydrolysant les composants du média
La différenciation de V. parahaemolyticus implique des changements majeurs dans la régulation de la division cellulaire, la morphologie cellulaire et le positionnement de machines macromoléculaires telles que flagellA et chimiotaxis - processus qui nécessitent tous une localisation spécifique des protéines selon le cycle cellulaire. Ainsi, la capacité d'étudier la localisation intracellulaire de ces protéines est essentielle à la compréhension des processus cellulaires susmentionnés. Pour effectuer de telles études, il faut une microscopie à fluorescence sur des cellules individuelles. Cela peut être particulièrement difficile lors de l'imagerie des cellules qui existent dans des populations bactériennes denses, comme c'est le cas pour les cellules moustiques. Il a été tenté d'induire une différenciation des mollusques dans les milieux liquides, ce qui pourrait générer des cellules individuelles pour des études de microscopie. Et bien que, au niveau de la transcription, ces cellules ont induit partiellement le programme de différenciation des mollusques, elles ne subissent pas les mêmes changements morphologiques distincts que les cellules de bourgeons complètement différenciées cultivées sur un milieu solide 8 . Cet article offre un protocole robuste et reproductible d'une méthode pour induire un coccinelleSur une surface de gélose. Le protocole produit une population de cellules gonflées facilement accessibles facilement disponibles pour une microscopie à une seule cellule et une analyse ultérieure. En outre, le protocole permet des études de localisation des protéines marquées par fluorescence à la fois dans les types de cellules nageuses et moustiques (sections 1, 2, 3, 4). En outre, le protocole décrit le flux de travail ultérieur sur la façon de traiter et d'analyser les données générées à partir d'expériences de microscopie de fluorescence, ce qui permet une analyse démographique des sociétés bactériennes (section 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Préparation de cellules électro-compétentes V. parahaemolyticus et électroporation d'ADN plasmidique dans des cellules nageuses
NOTE: La section suivante du protocole permet la préparation de cellules électro-compétentes et l'électroporation ultérieure d'ADN plasmidique dans des cellules nageuses. Cette étape est importante si des protéines fluorescentes s'expriment par voie ectopique à partir d'un plasmide.
- Sortir des cellules V. parahaemolyticus d'un stock de glycerol -80 ° C sur une plaque d'agar LB fraîche contenant 100 ug / ml d'ampicilline et incuber pendant une nuit à 37 ° C.
- Le lendemain, inoculer 200 ml de milieu LB avec une seule colonie de V. parahaemolyticus et l'incuber à 37 ° C dans des conditions de secousse jusqu'à obtention d'une DO 600 de 1,0. Il faut généralement 5-6 h d'incubation pour la culture cellulaire pour atteindre la densité optique souhaitée.
- Immédiatement transférer les cellules sur la glace et perfOu toutes les étapes supplémentaires sur la glace et dans des centrifugeuses pré-refroidies à 4 ° C.
- Récolter les cellules à 4 ° C pendant 10 min à 2 000 x g.
- Jeter le surnageant par décantation et ré-suspendre le culot cellulaire dans 25 ml d'une solution de saccharose 273 mM glacée (pH 7,4, tamponnée avec du KOH).
- Récolter les cellules à nouveau à 4 ° C pendant 10 min à 2000 x g. Répétez deux fois de plus.
- Remettre en suspension le culot cellulaire lavé dans 400 μl de solution de saccharose 273 mM glacée. Ensuite, ajouter du glycérol à une concentration finale de 15% vol / vol. Les cellules sont maintenant prêtes pour l'électroporation, mais peuvent également être congelées en portions aliquotes de 70 μL à -80 ° C pour une utilisation ultérieure.
- Pour l'électroporation, mélanger une aliquote de 70 μL de cellules électro-compétentes avec 100 à 1000 ng d'ADN plasmidique et transférer le mélange dans une cuvette d'électroporation glacée (0,2 cm d'écart d'électrode). Effectuer l'électroporation avec les réglages suivants: 25 μF, 2400 V et 200 Ω.
- Suspendre leLes cellules dans la cuvette d'électroporation dans 600 μL de bouillon LB, transfèrent dans un tube de 2 ml et incument tout en agitant à 37 ° C pendant 3 h.
- Faire avancer les cellules à 2 000 xg pendant 5 min et ré-suspendre la pastille dans 100 μL de bouillon LB. Étaler la suspension cellulaire sur des plaques d'agar LB sélectives contenant les antibiotiques nécessaires et incuber à 37 ° C pendant une nuit.
- Le lendemain, vérifiez les plaques pour la formation des colonies. Les colonies qui poussent portent le bon gène de résistance aux antibiotiques encodé sur le plasmide et peuvent maintenant être utilisées pour d'autres expériences.
2. Induction de la différenciation des cellules Swarmer
REMARQUE: Les étapes suivantes décrivent comment induire la différenciation de V. parahaemolyticus dans son cycle de vie des cellules gonflées et comment stimuler la prolifération sur les surfaces solides.
- Suspendre 4 g d'agarte de perfusion cardiaque (HI) dans 100 mL de ddH 2 O afin de préparer les plaques d'arrosage.
- Faire cuire soigneusement la solution d'agar HI au micro-ondes et secouer la bouteille de temps en temps jusqu'à dissolution de la poudre. Autoclave à 121 ° C pendant 20 min.
- Après autoclavage, refroidir l'agar HI à 60-65 ° C. Ajouter du 2,2'-bipyridyle à une concentration finale de 50 uM (solution mère de 50 mM dans 100% d'éthanol). Ajouter CaCl 2 à une concentration finale de 4 mM (solution mère de 4 M dans ddH 2 O). Si nécessaire, ajouter des antibiotiques dans la solution pour maintenir les plasmides.
REMARQUE: Si vous prévoyez d'utiliser un plasmide inducible, ajoutez l'agent inducteur à sa concentration finale.
ATTENTION: 2,2'-Bipyridyl: toxicité aiguë (par voie orale, cutanée, inhalation). Utilisez des gants et des lunettes de sécurité lors de la manipulation de ce produit chimique. - Verser 30 à 35 ml de la solution d'agar HI finale dans une boîte de Petri ronde de 150 mm et laisser la gélose se solidifier.
- Juste avant de repérer la culture cellulaire, sécher la plaque de gélose à 37 ° C pendant au moins 10 minutes (ou jusqu'à ce que les résidus liquides aient disparuPpeared, mais plus) vers le haut avec un couvercle ouvert.
REMARQUE: Les temps de séchage dépendent fortement de l'incubateur utilisé et les plaques fortement séchées ne permettent pas l'essaimage de V. parahaemolyticus . (Cette étape est très importante!) Les plaques doivent être utilisées en frais et ne doivent pas dépasser 2 à 3 heures. Les anciennes plaques seront trop sèches pour stimuler les essaims. - Inoculer une petite quantité de cellules du bord d'une colonie unique dans 5 ml de bouillon LB. Incuber la culture qui secoue à 37 ° C jusqu'à ce que la DO 600 = 0,8 soit atteinte, elle dure généralement environ 2-3 heures. Ensuite, les cellules sont prêtes à être repérées sur les plaques de gélose HI.
- Présentez 1 μL de culture cellulaire au centre d'une plaque de pulvérisation d'agar HI ( Figure 1A ).
- Laissez sécher le spot ( Figure 1B ).
- Cousez la plaque avec un ruban adhésif transparent et assurez-vous qu'elle est fermement fixée, sinon elle pourrait être détachée durant l'incubation durant la nuit ( figure 1C ).
NOTE: il estIl est très important que le sceau soit parfait. Évitez la formation de bulles d'air et de plis sur le ruban lorsqu'il est appliqué. - Incuber la plaque à 24 ° C pendant la nuit. Cela entraînera la formation d'une colonie d'essaim de V. parahaemolyticus avec des éruptions d'essaim s'étendant de la périphérie de la colonie d'essaim ( figure 2 ).
3. Préparation de V. parahaemolyticus Swarmer Cells for Fluorescence Microscopy
REMARQUE: Le protocole suivant décrit comment préparer des lames d'agarose à microscopie et l'empreinte subséquente d'évasements d'essaimage sur un tampon d'agarose pour obtenir des cellules de moustique uniques pour la microscopie.
- Pour préparer des lames d'agarose à la microscopie, ajouter 1 g d'agarose à 100 ml d'une solution de 20% vol / vol PBS et 10% vol / vol LB. Faire bouillir soigneusement la solution au micro-ondes pour dissoudre l'agarose et laisser refroidir jusqu'à 65-70 ° C tout en mélangeant avec un agitateur magnétique.
- Place acLe microscope maigre glisse sur une section parfaitement équilibrée d'un banc de travail. Couvrir les deux extrémités de la glissière avec deux couches de ruban adhésif à usage général, en fixant la glissière sur le banc de travail. La distance entre les deux morceaux de bande devrait être d'environ 3 cm.
REMARQUE: Les deux couches de bande créent une très faible élévation, qui déterminera la hauteur du tampon d'agarose. Il est important que l'espace de travail soit de niveau pour s'assurer que les cellules seront dans le même plan pour l'analyse de microscopie. - Pipeter ~ 250 μL de la solution d'agarose préalablement préparée sur la surface de verre non recouverte.
- Placez maintenant une deuxième glissière de microscope dans la même orientation que la partie inférieure en haut et appuyez légèrement vers le bas, de sorte que l'agarose résiduel puisse s'écouler sur les côtés.
- Laisser l'agarose se solidifier de 1 à 2 minutes, puis tirer lentement la glissière de verre supérieure du bas dans un mouvement horizontal.
- En utilisant un scalpel, couper tout agarose résiduel qui est attaché à laLes côtés de la glissière du microscope et retirent lentement la bande des extrémités de la glissière du microscope.
REMARQUE: la glissière d'agarose est maintenant prête et devrait être utilisée le plus tôt possible, car elle commencera lentement à se dessécher. - Pour effectuer une microscopie sur des cellules moustiques, découpez un morceau de gypse de 3 mm x 10 mm à partir du bord le plus externe d'une colonie grouillante ( figure 1D ). Il est très important de ne pas casser le joint d'étanchéité de la plaque d'essaim avant immédiatement avant le transfert des cellules de moustaches au toboggan du microscope. Une fois que le ruban est enlevé, les cellules de V. parahaemolyticus grouillantes commencent à se différencier en cellules de nageur.
REMARQUE: Assurez-vous de diriger les coupures de l'extérieur du bord de la colonie grouillante vers l'intérieur de la colonie ( Figure 1D ). De cette façon, vous pouvez empêcher la «contamination des nageurs» au bord de la colonie grouillante. - Transférer le morceau d'agarine sur une glissière d'agarose au microscope avec les cellules face à l'agarose par anD ( Figure 1E ). Cela imprègne les cellules grouillantes sur le tampon d'agarose.
- Après avoir attendu ~ 30 s, retirer soigneusement la gélose de l'agarose pad ( Figure 1F ).
- Placez une lamelle de verre sur le tampon d'agarose où les cellules ont été imprimées. Les cellules sont maintenant prêtes pour la microscopie.
REMARQUE: Il est important d'immerger immédiatement les cellules des nerfs, car les cellules gonflées initient lentement la différenciation à l'état de nageur.
4. Préparation de V. parahaemolyticus Swimmer Cell-cultures Pour Microscopie de Fluorescence
NOTE: Cette section du protocole décrit comment préparer une culture de V. parahaemolyticus pour effectuer une microscopie de fluorescence sur le type de cellule de nageur.
- Inoculer une petite quantité de cellules du bord d'une colonie unique dans 5 ml de bouillon LB. Incuber la culture qui secoue à 37 ° C pendant 1 h ou jusqu'à ce qu'une légère croissance de la cellule soit visible.
- ÀCette étape, si nécessaire, ajoute un agent inducteur pour l'expression de protéines d'intérêt. Dans cet exemple, le L-arabinose a été ajouté à une concentration finale de 0,2% (p / vol) afin d'induire l'expression de YFP-CheW 9 .
- Incuber la culture en agitant pendant 2 h supplémentaires à 37 ° C.
- Suivez les étapes 3.1-3.7 pour préparer des lames d'agarose à microscopie.
- Détacher 1 μL de culture cellulaire au centre du tampon d'agarose et laisser la tache incuber jusqu'à ce qu'elle soit sèche.
- Placez une lamelle de verre sur le tampon d'agarose où les cellules ont été repérées. Les cellules sont maintenant prêtes à être imagées sous le microscope à fluorescence.
5. Analyse d'image
Cette partie du protocole décrit un flux de travail pour l'analyse d'image, en particulier la façon d'extraire des données de fluorescence de cellules individuelles pour une analyse démographique.
- Avant de commencer l'analyse de l'image, assurez-vous que toutes les images microscopiques sont enregistrées au format TIF 16bit.
- Chargez le DIC (ou le contraste de phase) et les images de canal fluorescentes correspondantes dans le logiciel.
- Générer une image de recouvrement des deux canaux en sélectionnant "Affichage / superposition d'images". Réglez le nombre de photos ("# Images:") sur deux, puis sélectionnez l'image DIC dans le premier canal et l'image fluorescente dans le second canal.
- Sélectionnez l'outil "Multi-Line" dans la barre d'outils et marquez les cellules d'un pôle à l'autre au milieu de la cellule. Pour obtenir une liste de toutes les lignes générées (objets de ligne), ouvrez "Measure / Region Measurements". Configurez les mesures de la région pour afficher uniquement l'étiquette, la distance et l'intensité moyenne de la région.
- Calibrez la taille du pixel sous "Mesurer / Calibrer les distances" à la taille de pixel qui est spécifique à votre configuration de microscope et cliquez sur "Appliquer à toutes les images ouvertes".
- Transférez toutes les régions (objets de ligne) vers l'image du canal fluorescent. Sous "Régions / TransfEr Regions "sélectionnez l'image source (l'image de recouvrement) et l'image de destination (l'image du canal fluorescent). Sélectionnez" Toutes les régions "et appuyez sur" OK ".
REMARQUE: pour pouvoir reproduire plus tard les lignes exactes (objets de ligne, régions, ROI), ouvrez "Régions / Enregistrer des régions" et enregistrez les régions. - Exportez toutes les mesures de la région dans une feuille de calcul en ouvrant "Measure / Region Measurements" et en appuyant sur "Open Log". Confirmez pour ouvrir et exporter les données. Une fois que la feuille de calcul est ouverte en arrière-plan, expirez finalement les données en appuyant sur "F9: Log Data".
- Pour déterminer la position des foyers fluorescents le long de la cellule, ouvrez "Measure / Linescan". Réglez "Linescan Width" à une valeur afin que toute la largeur d'une cellule soit couverte par la région que vous avez créée précédemment. Cliquez avec le bouton droit de la souris dans le graphique de balayage de ligne et sélectionnez "Afficher les données du graphique". En cliquant avec le bouton gauche de la souris et en faisant glisser le curseur de la souris le long du balayagePoint d'intérêt, la fenêtre "Données graphiques" affiche le pixel / distance correspondant entre les deux points. Sélectionnez la ligne en surbrillance bleue, puis copiez le contenu.
REMARQUE: Le profil d'intensité de balayage de ligne complet peut être enregistré dans une feuille de calcul en appuyant sur "Log Data" dans la fenêtre "Linescan". Les données extraites peuvent maintenant être utilisées pour la visualisation dans des graphiques ou une analyse statistique supplémentaire. Les modèles de localisation sur le cycle cellulaire peuvent être facilement visualisés dans une représentation démographique de la longueur de la cellule et des intensités fluorescentes le long du corps cellulaire. Ces représentations peuvent être obtenues en utilisant les mêmes ROI précédemment sélectionnés. Les étapes suivantes donneront un exemple de génération de données démographiques similaires à celles illustrées aux figures 3C et 4C .- Dans les marques de région de chargement Fiji / ImageJ (.rgn) créées précédemment dans le logiciel (étape 5.6) à l'aide de "Importateur de fichiers Metamorph nd & ROI"; Alternativement, les régions d'intérêt (ROI) des cellules à analyser peuvent être créées directement à Fiji / ImageJ à l'aide de l'outil "segmenté".
- Ouvrez "Analyser / Outils / Gestionnaire ROI" et marquez toutes les entrées de la liste active ".
- Ensuite, cliquez sur "More / Multi Plot", puis sélectionnez "List" dans la nouvelle fenêtre "Multi Plot". Cliquez sur une entrée de table, puis sélectionnez "copier tout". Par la suite, collez dans une nouvelle feuille de calcul.
REMARQUE: assurez-vous que les données de la cellule la plus longue (deux colonnes X et Y correspondantes avec le plus nombre de lignes) est la dernière à droite dans la feuille de calcul. - Enregistrez la feuille de calcul en tant que "CSV (délimité par des virgules) (* .csv)".
- Téléchargez les scripts R à partir d'ici "https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles" 10. Les scripts trient les cellules par la longueur et normalisent les profils d'intensité fluorescente de toutes les cellules en moyenne de chaque fluorescence de la celluleE.
- Exécutez l'intégralité du script "profiles de cellules function.R" dans R [version 3.0.1; 11 ].
- Modifiez le script "example plots.R" dans la ligne 30 de sorte que le chemin du fichier se réfère au dossier dans lequel le fichier .csv généré précédemment est enregistré. En outre, modifiez le nom de fichier "profile.csv" dans la ligne 31 au nom de fichier choisi pour le fichier .csv généré à l'étape 5.9.4. Ensuite, exécutez "example plots.R" et suivez la documentation de "https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles" ainsi que les commentaires du fichier script pour générer une analyse démographique.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Induction de la différenciation et de la génération des colonies en essaimage
La figure 1 fournit un schéma des étapes importantes impliquées dans la production de colonies grouillantes de V. parahaemolyticus ( figure 1A-C ). Une culture de nageur a été repérée sur swarm-agar et incubée à 24 o C, induisant une différenciation et une prolifération des mollusques sur la surface solide de la gélose. Une image représentative d'une microscopie stéréoscopique d'une colonie grouillante est présentée à la Figure 2 . L'imagerie par microscopie stéréoscopique montre clairement des éruptions dynamiques s'étendant vers l'extérieur de la périphérie des colonies d'essaims. Un grossissement plus élevé révèle que, dans les cellules souches d'essaims, les cellules sont groupées en mono- ou bi-couches seulement, alors que dans le milieu des cellules de la colonie d'essaim sont empilées en plusieurs couches ( figure 2A ). Les fusées éclair peuvent être facilement transférées (comme décrit aux étapes 3.8-3.11,
Microscopie de fluorescence et analyse d'image
Figure 1: Induction de la différenciation et de la préparation des cellules pour l'imagerie par microscopie. Visualisation simplifiée du flux de travail pour produire des cellules gonflantes de V. parahaemolyticus et la préparation de diapositives de microscope pour l'analyse microscopique de cellules uncelles. ( A ) localiser 1 μL d'une culture de DO 600 = 0,8 de V. parahaemolyticus au centre d'une plaque de pulpe d'agar HI. ( B ) Incuber le tache jusqu'à ce qu'il soit séché et que les cellules soient attachées à la surface de la gélose. ( C ) Sceller la boîte de Petri avec du ruban adhésif transparent. Incuber la plaque à 24 ° C pendant 16 h. ( D ) Exciter soigneusement un petit morceau d'agar HI du bord extérieur de la colonie grouillante. ( E ) Transférer l'excision sur un micrOscopy agarose pad avec les cellules gonflées face à l'agarose pad. Après un court temps d'incubation de 30 s, les cellules des bourgeons sont imprimées sur le tampon d'agarose. ( F ) Retirez soigneusement la gousse excisée du tampon d'agarose et placez une lamelle de microscopie sur le dessus. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: L'organisation des cellules dans une colonie de virage V. parahaemolyticus . ( A ) Microscopie stéréoire d'une colonie de moustiques V. parahaemolyticus . Les panneaux supérieurs affichent le bord extérieur d'une colonie en expansion dans un grossissement croissant. Les panneaux inférieurs affichent une zone de la colonie grouillante entre le centre et le bord en augmentation croissante. Les flambeaux s'étendent de la périphérie deLa colonie d'essaims. ( B ) Les images représentatives de la microscopie DIC du bord de la colonie des moustaches (panneau supérieur) et une zone entre le centre et la périphérie (panneau inférieur) après le transfert des cellules des emplacements indiqués respectifs de la colonie grouillante. Les évasements d'essaim ont été imprimés directement sur un tampon d'agarose microscopique comme décrit aux étapes 3.8-3.11. Les cellules de la zone entre le centre et la périphérie ont d'abord été raclées de la colonie d'essaim et remises en suspension dans du bouillon LB, avant d'être repérées sur un microscope d'agarose. Barre d'échelle = 7,5 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: Localisation des tableaux de chimiotaxie dans les cellules nageuses de V. parahaemolyticus. ( A ) DIC et des microscopes fluorescentes de cellules de nageurs de type V sauvage de type Parahaemolyticus expriment ectopiquement YFP-CheW. ( B ) Graphique affichant la distribution des focaux YFP-CheW en traçant la distance des foyers des pôles cellulaires en fonction de la longueur de la cellule dans les cellules nageuses. ( C ) Analyse démographique des profils d' intensité de fluorescence des cellules de nageur V. parahaemolyticus exprimant YFP-CheW. Les cellules sont triées selon la longueur de la cellule et affichent une intensité relative de fluorescence. Barre d'échelle = 5 μm. Les panneaux B et C sont adaptés à partir de la référence 9 . Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4: Localisation des matrices de chimiotaxie dans les cellules Swarmer de V. parahaemolyticus. A ) Des images DIC et microscopie fluorescente de cellules de moustiquaires V. parahaemolyticus de type sauvage exprimant ectopiquement YFP-CheW. ( B ) Graphique affichant la distribution des focaux YFP-CheW en traçant la distance des foyers des pôles de la cellule en fonction de la longueur de la cellule dans les cellules moustiques. ( C ) Analyse démographique des profils d' intensité de fluorescence des cellules gonflantes de V. parahaemolyticus exprimant YFP-CheW. Les cellules sont classées par longueur de cellule et affichent une intensité relative de fluorescence. Barre d'échelle = 5 μm. Les panneaux B et C sont adaptés de la référence 9 . Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cet article rapporte une méthode pour l'imagerie microscopique de cellules de moustiquaires V. parahaemolyticus , suivie d'analyses en aval destinées à résoudre et quantifier la localisation subcellulaire et d'autres caractéristiques des protéines étudiées fluorescentes. Bien que plusieurs outils existent pour le traitement et l'analyse de l'image microscopique 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , l'analyse des cellules de vélos V. parahaemolyticus reste difficile surtout parce qu'elles existent normalement dans une communauté cellulaire dense et qu'il existe une forte variation de la longueur de la cellule ( Figure 2 ). Par conséquent, la détection automatisée des cellules est parfois défectueuse et donc les résultats sont peu fiables. Ce protocole décrit un pipeline conçu pour développer , imaginer et analyser des cellules envahissantes de V. parahaemolyticus , adapté à la spécificationLes besoins spécifiques de ces cellules, comme un environnement de croissance contrôlée sur des analyses d'image en surface et en aval qui tiennent compte de la présence de cellules de longueurs variables qui se développent à proximité.
La capacité d'exprimer ectopiquement une protéine d'intérêt à partir d'un plasmide peut être importante pour plusieurs expériences, par exemple l' expression de protéines marquées par fluorescence pour des études de microscopie ou la complémentation de délétions de gènes. Ici, le procédé de préparation de cellules chimiquement compétentes et l'électroporation de l'ADN plasmidique dans V. parahaemolyticus est également décrit. L'avantage de l'électroporation par conjugaison, souvent utilisé pour V. parahaemolyticus , est que le squelette du plasmide n'a pas besoin d'être modifié pour permettre la conjugaison. Néanmoins, certaines précautions doivent être prises; Comme décrit à l'étape 1.2, il est très important d'atteindre une densité cellulaire de DO 600 = 1.0. Aux densités optiques inférieures, les cellules liraient sur l'électroporatiSur et à des densités plus élevées, le plasmide n'est pas absorbé par les cellules. En outre, une centrifugation trop sévère des cellules V. parahaemolyticus (étapes 1.4-1.6) diminuera drastiquement l'efficacité de l'électroporation. Il est également important de ré-suspendre soigneusement le culot cellulaire pendant les étapes de lavage pour générer des cellules électro-compétentes.
Bien que la préparation d'une culture cellulaire semble banale, la densité de la culture est très importante pour la performance de l'essaimage. Généralement, une culture cellulaire dans la phase de croissance exponentielle précoce (OD 600 <0,5) produira une colonie plus vaste d'essaimage pendant l'incubation pendant une nuit que la culture en phase stationnaire exponentielle ou anticipée tardive. Selon l'expérience, une plus grande colonie en essaimage pourrait être bénéfique. Cependant, pour comparer l'expansion et la morphologie des colonies entre différentes souches cultivées sur la même plaque de poussière d'agar HI, il est important d'avoir assez d'espace disponible entre les colonies d'essaimage individuelles. Cela peut êtreC'est-à-dire en repérant une culture cellulaire de densité optique plus élevée qui aboutira habituellement à de petites colonies en essaimage.
L'induction du phénotype de l'essaimage varie de manière significative chez les espèces bactériennes et leur reproductibilité est fortement influencée par des facteurs tels que la composition de gélose et de nutriments, la température ambiante et la teneur en humidité des environnements et du milieu de croissance. Par conséquent, les changements mineurs dans le protocole et l'environnement externe influent de manière significative sur les résultats du dosage en essaim et l'induction de la différenciation des mollusques. Des protocoles pour induire l'essaimage d'autres espèces bactériennes telles que Pseudomonas aeruginosa et Bacillus subtilis ont été rapportés 19 . Les étapes décrites dans ce protocole produiront de manière fiable le type de cellule de mousse de V. parahaemolyticus et les maintiendront sous la forme de colonies grouillantes qui produiront des éruptions d'essaimage à une seule couche au bord de la colonie. Effectuer des performances stables etDes expériences reproductibles sur le type de cellules de mousse de V. parahaemolyticus , la préparation des plaques de gélose HI grouillant est la partie la plus importante de ce protocole. En particulier, l'étape de séchage peut nécessiter une optimisation, car chaque incubateur fonctionnera différemment. Un autre facteur qui peut influencer le comportement des essaims est le type de plastique utilisé dans les boîtes de Petri. Les plats de Petri typiques utilisés dans notre laboratoire pour effectuer des expériences d'essaimage sont fabriqués à partir de polystyrène (PS). Cependant, l'utilisation de boîtes de Petri en polyéthylène basse densité (PE LD) a produit des résultats mitigés dans les essais d'essaimage. Il est essentiel de suivre les étapes décrites, car seules des colonies de récolte reproductibles qui montrent une formation distincte de la flambée périphérique, qui permettent une microscopie cellulaire unique.
Sans aucun doute, différentes approches peuvent être prises pour afficher les résultats obtenus par des études de microscopie fluorescente de cellules de pansement V. parahaemolyticus . Pour l'instantE, le programme largement utilisé MicrobeTracker 16 représente une alternative plausible. L'application MicrobeTracker récemment disponible Oufti 20 , qui n'exige pas MATLAB, est également une autre alternative. Cependant, l'utilisation d'images de contraste d'interface différentielle (DIC) n'est pas possible dans Oufti, et l'imagerie par contraste de phase n'est pas appropriée pour discerner la segmentation cellulaire dans les cellules ennemies. En outre, tous les microscopes ne sont pas équipés pour une imagerie à contraste de phase et, en retour, l'imagerie par contraste de phase n'est pas adaptée à toutes les analyses de microscopie. Un autre outil prometteur, gratuit et basé sur ImageJ, est MicrobeJ 17 , mais encore une fois, seul le contraste de phase et les images fluorescentes peuvent être utilisées. En outre, ce protocole ne permet que l'imagerie et l'analyse des cellules à des moments précis de leur cycle de vie. Cependant, un excellent protocole décrivant l'imagerie temporelle et l'analyse d'image suivante, qui permet de suivre un seulLes trajectoires cellulaires et la dynamique des protéines 21 peuvent également être appliquées à V. parahaemolyticus .
En suivant les étapes décrites dans ce protocole, les scientifiques pourront effectuer une microscopie de fluorescence monocellulaire fiable et ré-produisible à la fois sur le type de nageuse et de type Swarmer de V. parahaemolyticus . Ce protocole détaille un moyen robuste de transformer V. parahaemolyticus de son nageur en son type de cellule. En imprimant la monocouche de cellules gonflées à partir des éruptions périphériques des colonies en essaimage sur un tampon d'agarose, on peut observer la localisation intracellulaire des protéines, la pipeline pour l'analyse d'image peut être appliquée à d'autres espèces bactériennes qui existent dans les communautés bactériennes où les cellules se développent Très proche et les situations où l'analyse automatisée de l'image pourrait ne pas être avantageuse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêts n'a été déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la Société Max Planck.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media components | |||
| LB medium | Roth | X968.3 | |
| Difco Agar, granulated | BD | 214510 | For preparation of LB agar with LB medium |
| Difco Heart Infusion Agar | BD | 244400 | For preparation of HI agar swarming plates |
| Agarose NEEO, ultra quality | Roth | 2267.3 | For preparation of microscopy agarose pads |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Additives | |||
| L-arabinose | Roth | 5118.3 | Used to induce pBAD derivatives |
| 2,2`-Bipyridyl | Sigma Aldrich | D216305-25G | For preparation of HI agar swarming plates |
| Calcium chloride dihydrate | Roth | 5239.1 | For preparation of HI agar swarming plates |
| Ampicillin sodium salt | Roth | K029.3 | |
| Chloramphenicol | Roth | 3886.3 | |
| PBS buffer | - | - | Standard recipe for Phosphate-buffered saline |
| D(+) Sucrose | Roth | 4621.1 | For preparation of electrocompetent cells |
| Glycerol | Roth | 3783.5 | For preparation of electrocompetent cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hardware | |||
| Petri dish 150 mm x 20 mm with cams | Sarstedt | 82.1184.500 | For preparation of HI agar swarming plates |
| kelvitron t (B 6420) | Heraeus | - | Used for drying HI agar swarming plates |
| Gene Pulser Xcell Microbial System | BioRad | 1652662 | Used for elctroporation of plasmid DNA |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| MetaMorph Offline (version 7.7.5.0) | Molecular Devices | - | Used for microscopy image analysis |
| Excel | Microsoft | - | Used for microscopy data analsis |
References
- McCarter, L., Hilmen, M., Silverman, M. Flagellar dynamometer controls swarmer cell differentiation of V. parahaemolyticus. Cell. 54 (3), 345-351 (1988).
- Kawagishi, I., Imagawa, M., Imae, Y., McCarter, L., Homma, M. The sodium-driven polar flagellar motor of marine Vibrio as the mechanosensor that regulates lateral flagellar expression. Mol. Microbiol. 20 (4), 693-699 (1996).
- Ulitzur, S.
- Ulitzur, S. Effect of temperature, salts, pH, and other factors on the development of peritrichous flagella in Vibrio alginolyticus. Arch. Microbiol. 104 (3), 285-288 (1975).
- Ulitzur, S. The mechanism of swarming of Vibrio alginolyticus. Arch. Microbiol. 104 (1), 67-71 (1975).
- Gode-Potratz, C. J., Chodur, D. M., McCarter, L. L. Calcium and iron regulate swarming and type III secretion in Vibrio parahaemolyticus. J. Bacteriol. 192 (22), 6025-6038 (2010).
- McCarter, L., Silverman, M. Iron regulation of swarmer cell differentiation of Vibrio parahaemolyticus. J. Bacteriol. 171 (2), 731-736 (1989).
- Gode-Potratz, C. J., Kustusch, R. J., Breheny, P. J., Weiss, D. S., McCarter, L. L. Surface sensing in Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization and virulence. Mol. Microbiol. 79 (1), 240-263 (2011).
- Heering, J., Ringgaard, S. Differential Localization of Chemotactic Signaling Arrays during the Lifecycle of Vibrio parahaemolyticus. Front Microbiol. 7 (November), 1-12 (2016).
- Cameron, T. A., Anderson-Furgeson, J., Zupan, J. R., Zik, J. J., Zambryski, P. C. Peptidoglycan synthesis machinery in Agrobacterium tumefaciens during unipolar growth and cell division. mBio. 5 (3), (2014).
- Development Core Team, R. F. F. S. C. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. 1, 2673 (2008).
- Ringgaard, S., et al. ParP prevents dissociation of CheA from chemotactic signaling arrays and tethers them to a polar anchor. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (2), E255-E264 (2014).
- Ringgaard, S., Schirner, K., Davis, B. M., Waldor, M. K. A family of ParA-like ATPases promotes cell pole maturation by facilitating polar localization of chemotaxis proteins. Genes Dev. 25, 1544-1555 (2011).
- Vischer, N. O. E., et al. Cell age dependent concentration of Escherichia coli divisome proteins analyzed with ImageJ and ObjectJ. Front Microbiol. 6 (JUN), (2015).
- Schneider, C. a, Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Sliusarenko, O., Heinritz, J., Emonet, T., Jacobs-Wagner, C. High-throughput, subpixel precision analysis of bacterial morphogenesis and intracellular spatio-temporal dynamics. Mol. Microbiol. 80 (3), 612-627 (2011).
- Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis. Nat. Microbiol. 1, 16077 (2016).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100 (2006).
- Morales-Soto, N., et al. Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays. J. Vis. Exp. (98), e52338 (2015).
- Paintdakhi, A., et al. Oufti: An integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis. Mol. Microbiol. 99 (4), 767-777 (2016).
- de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. -W. Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy. J. Vis. Exp. (53), e1-e6 (2011).
