3D Microtissues voor injecteerbare regeneratieve therapie en High-throughput Drug Screening

Summary

Dit protocol beschrijft de fabricage van elastische 3D macroporeuze microcryogels door de integratie van microfabrication met cryogelation-technologie. Bij het laden met cellen, worden 3D-microtissues gegenereerd, die kan gemakkelijk ingespoten in vivo om regeneratieve therapie of geassembleerd tot arrays voor in vitro high-throughput drug screening.

Abstract

Wij hebben om een upgrade celkweek met traditionele 2D naar 3D-celkweek, microfabrication geïntegreerd met cryogelation-technologie voor de productie van macroporeuze microscale cryogels (microcryogels), die kunnen worden geladen met allerlei celtypes te vormen van de 3D microtissues. Hierin presenteren wij het protocol om veelzijdige 3D microtissues en hun toepassingen in regeneratieve therapie en drug screening. Grootte en vorm-controleerbare microcryogels kan worden vervaardigd op een matrix-chip, die kan worden geoogst uit-chip als individuele cel-geladen dragers voor injecteerbare regeneratieve therapie of verder worden gemonteerd op de chip in 3D microtissue arrays voor high-throughput drug screening. Vanwege de hoge elastische aard van deze microscale cryogels vertonen de 3D microtissues grote injectiecapaciteit voor minimaal invasieve celtherapie door cellen te beschermen tegen mechanische schuintrekken kracht tijdens de injectie. Dit zorgt voor verbeterde cel overleven en therapeutisch effect in de muismodel van het ledemaat ischemie. Ondertussen, vergadering van 3D microtissue arrays in een standaardindeling van 384-multi-goed vergemakkelijkt het gebruik van gemeenschappelijke laboratoriumfaciliteiten en apparatuur, waardoor hoge gegevensdoorvoer drug screening op dit veelzijdige 3D cel cultuur platform.

Introduction

Traditionele celkweek op platte tweedimensionale (2D) oppervlakken, zoals een schotel van cultuur of multi goed platen, kan nauwelijks cel dicht bij hun eigen bestuurlijk gedrag uitlokken. Nauwkeurige recapitulatie van inheemse cellulaire microenvironments, die bestaan uit verschillende celtypes, extracellulaire matrices en bioactieve oplosbare factoren in driedimensionale (3D) platforms^{1,2,3 ,4}, is van essentieel belang voor de bouw van biomimicking weefsels in vitro voor toepassingen in de tissue engineering, regeneratieve geneeskunde, fundamentele biologie onderzoek en drug discovery^{5,6,7 ,8,9}.

In plaats van 2D celcultuur, 3D-celkweek wordt veel gebruikt om vooraf biomimetische micro-architectuur en functionele kenmerken van cellen gekweekt in vitro. Een populaire 3D cel cultuur methode is om de samengevoegde cellen in spheroïden^7,8,9,10. Cellulaire spheroïden kunnen worden geïnjecteerd om gewonde weefsels met verbeterde cellulaire retentie en de overleving in vergelijking met de injectie van verspreide cellen. Echter, niet-uniforme sferoïde maten en onvermijdelijk mechanische schade opgelegd cellen vloeistof schuintrekken gewapenderhand tijdens injectie leiden tot slechte cel therapeutische effecten^11,12,13. Evenzo heeft de inherent niet-uniformiteit tijdens samenvoeging van spheroïden hun vertaling naar 3D cel-gebaseerde high-throughput drug screening uitdagende¹⁰gemaakt.

Een andere methode voor 3D-celkweek wordt bereikt met de hulp van biomaterialen, meestal ingekapseld in de cellen in waterige hydrogels of poreuze steigers. Het zorgt voor meer flexibiliteit bij de bouw van 3D platforms. Voor therapie, zijn cellen ingekapseld in bulk steigers meestal geleverd aan dierlijke lichaam via chirurgische implantatie, die is invasieve en traumatisch, vandaar zijn brede vertaling naar bed te beperken. Aan de andere kant, inschakelen waterige hydrogels minimaal invasieve therapie door het injecteren van cellen gesuspendeerd in hydrogel voorloper oplossing waardoor in situ gelering via thermo-, chemische of enzymatische crosslinking¹¹-dierlijke organen. Echter als cellen worden terwijl de hydrogel voorlopers nog in een waterige staat zijn afgeleverd, worden ze ook blootgesteld aan mechanische schuintrekken tijdens de injectie. Niet alleen dus, kan chemische of enzymatische crosslinking tijdens in situ gelering hydrogel ook schade aan cellen binnen opleggen. Voor drug screening problemen biomaterial-bijgewoonde celculturen met uniformiteit, de controleerbaarheid en de doorvoer. Met behulp van hydrogels, zijn cellen meestal betrokken tijdens gelering, waarmee het proces invloed kan zijn op levensvatbaarheid van de cellen en functie. Gelering tijdens cel zaaien belemmert ook gebruik door de meeste high-throughput apparatuur, aangezien de hydrogel worden gehouden op het ijs moeten kan om te voorkomen dat gelering voor cel zaaien, en de hydrogel misschien verstrekking tips, die zijn meestal erg dun om ervoor te zorgen nauwkeurigheid voor jam High-throughput screening. Pre-gevormde steigers kon potentieel scheiden biomaterial fabricage procedures van de cultuur van de cel, maar de meeste steiger gebaseerde producten zijn beschikbaar als stortgoederen met relatief lagere doorvoer¹⁴.

Om sommige van de tekortkomingen van de huidige 3D kweekmethoden te overwinnen, hebben wij een microfabrication-cryogelation, geïntegreerde technologie om een off-the-shelf en gebruiksvriendelijke microcryogel matrix chip¹⁵ontwikkeld. In dit protocol, is gelatine geselecteerd om te illustreren de microcryogel fabricage techniek zoals het is biocompatibel, afbreekbaar, rendabel, en geen verdere wijziging vereist voor bevestiging van de cel is. Andere polymeren van natuurlijke of synthetische bronnen kunnen ook worden gebruikt voor de fabricage, afhankelijk van de toepassing. Via deze technologie, kunnen wij fabriceren verkleinde en zeer elastische microcryogels met regelbare grootte, vorm en indeling. Wanneer geladen met allerlei celtypes, kon 3D microtissues worden gevormd voor diverse toepassingen. Deze unieke functies inschakelen gewenste injectiecapaciteit, cel bescherming en het behoud van de plaats-geleide na injectie in vivo voor verbeterde therapeutische effecten. Niet alleen dus, kan de microcryogels verder worden verwerkt tot 3D microtissue arrays die compatibel met de gemeenschappelijke laboratoriumapparatuur en -instrumenten zijn te realiseren van hoge-doorvoer celkweek voor veelzijdige drug screening en andere cellulaire assays. Hierin leggen we de productie-procédé van microcryogels en de nabehandeling als individuele 3D microtissues of 3D microtissue arrays voor twee belangrijke toepassingen, celtherapie en drug screening, respectievelijk^10,15 .

Protocol

dierproeven gevolgd strikt protocol goedgekeurd door de ethische commissie van dier op het Center of Biomedical Analysis, Tsinghua Universiteit. Onder goedkeuring van de ethische Commissie, menselijk vetweefsel is verkregen uit het departement van plastische chirurgie van Peking Unie ziekenhuis met geïnformeerde toestemming van de patiënten. 1. fabricage van 3D Microcryogels ontwerp en de fabricage van microstencil matrix chips gebruik een commerciële so…

Representative Results

Fabricage en karakterisering van microcryogels voor de vorming van de 3D microtissue. Volgens dit protocol, microcryogels werden vervaardigd vorm de 3D microtissues en individuele microcryogels of microcryogel arrays en werden toegepast op de regeneratieve therapie en drug screening, respectievelijk (Figuur 1). Microstencil matrix chips vervaardigd uit PMMA waren toegepast als micro…

Discussion

Regeneratieve geneeskunde en in vitro modellen voor drug screening zijn twee belangrijke toepassingen voor weefsel engineering^5,6,7,8,9. Terwijl deze twee toepassingen enorm verschillende behoeften hebben, ligt een gemeenschappelijke grond tussen hen in de noodzaak van een meer biomimetische culturing voorwaarde te verbeteren cel functies<sup class="x…

Materials

Gelatin	sigma	G7041	All other reagents were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) unless otherwise indicated.
Glutaraldehyde	J&K	902042	Used as crosslinker in preparation of material.
Glass cover slip (24X50mm)	CITOGLASS, China	10212450C	To scrape prcursor solution onto microstencils array chips.
Sodium borohydride, NaBH4	Beijing Chemical Works	116-8	To wash remaining glutaraldehyde away after gelation.
Vacuum jar	asperts, China	VC8130	To preserve microgels under vacuum.
Polymethylmethacrylate (PMMA) sheets	Sunjin Electronics Co., Ltd, China		Ordinary PMMA sheets.
Rayjet laser system	Rayjet, Australia	Rayjet 50 C30	To engrave PMMA sheets to form wells.
Plasma Cleaner	Mycro Technologies, USA	PDC-32G	To make PMMA hyphophilic.
Lyophilizer	Boyikang, China	SC21CL	To lyophilize materials.
Trypan Blue solution (0.4%)	Zhongkekeao, China	DA0065	To dye microgels.
Doxorubicin hydrochloride	ENERGY CHEMICAL, China	A01E0801360010	To test drug resistance of cells in 2D or 3D microgel.
Live/dead assay	Dojindo Molecular Technologies (Kumamoto, Japan)	CS01-10	To distinguish alive and dead cells.
Cell Titer-Blue	Promega (Wisconsin, USA).	G8080	To test cell viability.
Cell strainer	BD Biosciences, USA	352360	To collect microgels.
D-Luciferin	SYNCHEM (Germany)	s039	To tack cells.
Scanning electron microscope	FEI, USA	Quanta 200	To characterize microgel morphology.
Mechanical testing machine	Bose, USA	3230	To measure mechanical features.
Programmable syringe pump	World Precision Instruments, USA	ALADINI 1000	To test injactabiliy.
Digital force gauge	HBO, Yueqing Haibao Instrument Co., Ltd., China	H-50	To test injactabiliy.
Ethylene oxide sterilization system	Anprolene, Anderson Sterilization, Inc., Haw River, NC	AN74i	To sterilize microgels with ethylene oxide gas.
Microplate reader	Molecular Devices,USA	M5	To measure fluorescence intensity in micro-array.
Confocal microscope	Nikon, Japan	A1Rsi	To observe cell distribution in 3D.
Xenogen  Lumina II imaging system	Caliper Life Sciences, USA	IVIS	To track cell in animals.
Liquid work stataion	Apricot design,USA	S-pipette	To load medium or cell suspension high-throuputly.