Microtissues 3D para terapia regenerativa injetável e triagem de drogas de alto rendimento

Summary

Este protocolo descreve a fabricação de microcryogels elástica 3D se integrando microfabrication com tecnologia cryogelation. Durante o carregamento com células, microtissues 3D são gerados, que pode ser facilmente injetado em vivo para facilitar a terapia regenerativa ou montadas em matrizes para em vitro triagem de drogas de alto rendimento.

Abstract

Para atualizar a cultura celular 2D tradicional para cultura de células 3D, integramos microfabrication com tecnologia cryogelation para produzir se microescala cryogels (microcryogels), que pode ser carregado com uma variedade de tipos de células para formar o microtissues 3D. Aqui, apresentamos o protocolo para fabricar microtissues 3D versátil e suas aplicações em terapia regenerativa e de despistagem de drogas. Tamanho e forma-controláveis microcryogels podem ser fabricados em um chip de matriz, que pode ser colhido fora do chip como transportadoras carregados de células individuais para terapia regenerativa injetável ou ainda ser montados em-microplaqueta em 3D microtissue matrizes para alta produtividade triagem de drogas. Devido à natureza elástica elevada destes cryogels de microescala, os microtissues 3D exibem grande Injectabilidade para terapia celular minimamente invasiva, protegendo as células de força de cisalhamento mecânico durante a injeção. Isso garante a sobrevivência celular melhorada e efeito terapêutico no modelo de isquemia do membro do rato. Enquanto isso, montagem de matrizes de microtissue 3D em um formato padrão de 384-multi-bem facilita o uso do comum instalações laboratoriais e equipamentos, permitindo que sobre esta plataforma de cultura de células 3D versátil de despistagem de drogas de alto rendimento.

Introduction

Cultura celular tradicional superfícies achatadas bidimensional (2D), como um prato de cultura ou placas multi bem, dificilmente pode eliciar comportamentos de celular perto de seus Estados nativos. Recapitulação exata do microambiente celular nativo, que são compostos por vários tipos de células, matrizes extracelulares e bioativos fatores solúveis em tridimensional (3D) arquiteturas^{1,2,3 ,4}, é essencial para construir biomimicking tecidos em vitro para aplicações na medicina regenerativa, engenharia de tecidos, biologia fundamental pesquisa e droga descoberta^{5,6,7 ,8,9}.

Em vez de cultura de células 2D, cultura de células 3D é amplamente utilizada para avançar biomimetic microarquitetura e características funcionais das células cultivadas em vitro. É um método de cultura de células 3D popular células agregadas em esferoides^7,8,9,10. Esferoides celulares podem ser injetados para tecidos feridos com maior retenção de celular e sobrevivência em comparação com a injeção de células dispersas. No entanto, não-uniforme esferoide tamanhos e inevitável lesão mecânica imposta sobre as células pela força de cisalhamento do fluido durante a injeção levam a pobre célula efeitos terapêuticos^11,12,13. Da mesma forma, a não-uniformidade inerente durante a agregação de esferoides fez sua tradução para 3D baseada em célula elevado-throughput de despistagem de drogas desafiador¹⁰.

Outro método para cultura de células 3D é alcançado com a ajuda de biomateriais, que encapsula normalmente células em hidrogel aquosa ou andaimes porosas. Permite maior flexibilidade na construção de arquiteturas 3D. Para a terapia, células encapsuladas em andaimes em massa geralmente são entregues ao corpo animal através da implantação cirúrgica, que é invasivo e traumático, portanto, restringindo sua tradução ampla para o leito. Por outro lado, aquosa hidrogel permitem terapia minimamente invasiva através da injeção de células suspendidas em solução de precursor de hidrogel em corpos de animais, permitindo em situ gelificação através do thermo-, reticulação química ou enzimática¹¹. No entanto, como as células são entregues enquanto os precursores de hidrogel ainda estão em um estado aquoso, eles estão também expostos a cisalhamento mecânico durante a injeção. Não só isso, reticulação química ou enzimática durante em situ gelificação de hidrogel também pode impor danos às células dentro. Para triagem de drogas, culturas de células de biomaterial assistida enfrentam problemas com taxa de transferência, controlabilidade e uniformidade. Usando o hidrogel, células são normalmente envolvidos durante a gelificação, pelo qual o processo pode afetar a função e viabilidade celular. Gelificação durante a semeadura da célula também dificulta o uso pela maioria dos equipamentos de alto rendimento, desde que o hidrogel pode precisar de ser mantido no gelo para evitar gelificação antes célula semeadura, e o hidrogel pode jam aplicadora dicas, que são geralmente muito finas, para garantir a precisão para seleção da elevado-produção. Pré-formado andaimes potencialmente poderiam separar os procedimentos de fabricação do biomaterial de cultura de células, porém a maioria produtos baseados em andaime estão disponíveis como produtos a granel com relativamente baixa taxa de transferência¹⁴.

Para superar algumas das deficiências dos métodos de cultura 3D atual, nós desenvolvemos uma tecnologia integrada microfabrication-cryogelation para fabricar uma prateleira e user-friendly microcryogel matriz microplaqueta¹⁵. Neste protocolo, a gelatina é selecionada para exemplificar a técnica de fabricação de microcryogel como é biocompatível, biodegradável, cost-effective, e nenhuma modificação adicional é necessária para a fixação da célula. Outros polímeros de fontes naturais ou sintéticas também podem ser usados para a fabricação, dependendo da aplicação. Através desta tecnologia, nós podemos fabricar microcryogels miniaturizados e altamente elástica com tamanho controlável, forma e layout. Quando carregado com uma variedade de tipos de células, microtissues 3D poderia ser formado para várias aplicações. Estas características únicas permitem Injectabilidade desejada, protecção celular e retenção local-dirigido após injeção na vivo para efeitos terapêuticos reforçadas. Não só isso, o microcryogels poderia ser tratados posteriormente para formar matrizes de microtissue 3D que são compatíveis com equipamentos comuns de laboratório e instrumentos para realizar a cultura de células de alto rendimento para triagem de drogas versátil e outros ensaios celulares. Neste documento, serão detalhamos o processo de fabricação de microcryogels e seu tratamento pós como individuais microtissues 3D ou 3D microtissue matrizes para duas importantes aplicações, terapia celular e despistagem de drogas, respectivamente^10,15 .

Protocol

as experiências com animais seguiram rigoroso protocolo aprovado pelo Comitê de ética Animal no centro de análise biomédica, Universidade de Tsinghua. Sob aprovação do Comitê de ética, o tecido adiposo humano foi obtido do departamento de cirurgia plástica de Peking Union Hospital com consentimento informado dos pacientes. 1. fabricação de 3D Microcryogels Design e fabricação de chips de matriz microstencil uso um software comercial para matri…

Representative Results

Fabricação e caracterização de microcryogels para a formação de microtissue 3D. De acordo com este protocolo, microcryogels foram fabricados para o 3D de forma microtissues e microcryogels individuais ou matrizes de microcryogel e foram aplicados à terapia regenerativa e de despistagem, respectivamente de drogas (Figura 1). Fichas de matriz Microstencil fabricadas a partir de…

Discussion

Regenerativos modelos medicina e in vitro de despistagem de drogas são dois importantes aplicações para tecido engenharia^5,6,7,8,9. Enquanto esses dois aplicativos têm necessidades muito diferentes, um terreno comum entre eles encontra-se na necessidade de um mais biomimetic condição de cultivo para aumentar celular funções^19…

Materials

Gelatin	sigma	G7041	All other reagents were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) unless otherwise indicated.
Glutaraldehyde	J&K	902042	Used as crosslinker in preparation of material.
Glass cover slip (24X50mm)	CITOGLASS, China	10212450C	To scrape prcursor solution onto microstencils array chips.
Sodium borohydride, NaBH4	Beijing Chemical Works	116-8	To wash remaining glutaraldehyde away after gelation.
Vacuum jar	asperts, China	VC8130	To preserve microgels under vacuum.
Polymethylmethacrylate (PMMA) sheets	Sunjin Electronics Co., Ltd, China		Ordinary PMMA sheets.
Rayjet laser system	Rayjet, Australia	Rayjet 50 C30	To engrave PMMA sheets to form wells.
Plasma Cleaner	Mycro Technologies, USA	PDC-32G	To make PMMA hyphophilic.
Lyophilizer	Boyikang, China	SC21CL	To lyophilize materials.
Trypan Blue solution (0.4%)	Zhongkekeao, China	DA0065	To dye microgels.
Doxorubicin hydrochloride	ENERGY CHEMICAL, China	A01E0801360010	To test drug resistance of cells in 2D or 3D microgel.
Live/dead assay	Dojindo Molecular Technologies (Kumamoto, Japan)	CS01-10	To distinguish alive and dead cells.
Cell Titer-Blue	Promega (Wisconsin, USA).	G8080	To test cell viability.
Cell strainer	BD Biosciences, USA	352360	To collect microgels.
D-Luciferin	SYNCHEM (Germany)	s039	To tack cells.
Scanning electron microscope	FEI, USA	Quanta 200	To characterize microgel morphology.
Mechanical testing machine	Bose, USA	3230	To measure mechanical features.
Programmable syringe pump	World Precision Instruments, USA	ALADINI 1000	To test injactabiliy.
Digital force gauge	HBO, Yueqing Haibao Instrument Co., Ltd., China	H-50	To test injactabiliy.
Ethylene oxide sterilization system	Anprolene, Anderson Sterilization, Inc., Haw River, NC	AN74i	To sterilize microgels with ethylene oxide gas.
Microplate reader	Molecular Devices,USA	M5	To measure fluorescence intensity in micro-array.
Confocal microscope	Nikon, Japan	A1Rsi	To observe cell distribution in 3D.
Xenogen  Lumina II imaging system	Caliper Life Sciences, USA	IVIS	To track cell in animals.
Liquid work stataion	Apricot design,USA	S-pipette	To load medium or cell suspension high-throuputly.