Avancée des Techniques de microscopie confocale afin d’étudier les interactions entre protéines et cinétique aux lésions de l’ADN
Summary
Laser microirradiation est un outil utile pour l’étude de la réparation de l’ADN dans les cellules vivantes. Une approche méthodologique pour l’utilisation des lasers UVA pour induire diverses lésions de l’ADN est montrée. Nous avons optimisé une méthode pour microirradiation locale qui gère le cycle cellulaire normal ; ainsi, les cellules irradiées passent par mitose.
Abstract
Microirradiation locale avec des lasers représente un outil utile pour l’étude des processus liés à la réparation ADN dans des cellules vivantes. Nous décrivons ici une approche méthodologique à l’analyse cinétique de protéine aux lésions de l’ADN sur les interactions temps ou protéines sur localement microirradiated la chromatine. Nous montrons aussi comment reconnaître les différentes phases du cycle cellulaire en utilisant le système cellulaire Fucci pour étudier la cinétique de protéines cycle cellulaire-dépendante aux lésions de l’ADN. Une description méthodologique de l’utilisation de deux lasers UV (355 nm et 405 nm) pour induire différents types de dommages à l’ADN est également présentée. Seulement le cellules microirradiated de la 405 nm diode laser s’est déroulé normalement par le biais de mitose et sont dépourvues de dimères de pyrimidine de cyclobutane (CPDs). Nous montrons aussi comment les cellules de microirradiated peuvent être fixés à un moment donné pour effectuer l’immunodétection des protéines endogènes d’intérêt. Pour les études de réparation de l’ADN, nous décrivons en outre l’utilisation de méthodes biophysiques y compris FRAP (récupération de Fluorescence après photoblanchiment) et FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) dans les cellules survenant spontanément foyers de dommages d’ADN. Nous montrons également une application de FLIM-FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) dans les études expérimentales des interactions protéine-protéine.
Introduction
Lésions de l’ADN entraîne l’apparition de lésions de l’ADN consistant en cyclobutane dimères de pyrimidine (CPDs), 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine et simple brin ou double-brins1,2. Rayons gamma sont la forme de rayonnements ionisants avec la plus haute énergie et une pénétrance élevée, donc cette source de rayonnement est largement utilisée en radiothérapie3. D’autre part, expérimentalement induit des lésions de l’ADN provoquée par exposition naturelle d’imite les lasers UV à la lumière UV. UVA microirradiation, comme une méthode d’examen microscopique, représente un outil expérimental pour l’étude des lésions de l’ADN dans les cellules vivantes individuels. Microirradiation a été utilisée pour la première fois il y a 40 ans afin de révéler l’organisation du chromosome régions4,5. Cette technique est fortement tributaire de deux propriétés fonctionnelles des microscopes confocaux ou les limites techniques du nanoscopy moderne. Pour provoquer des lésions de l’ADN, les cellules peuvent être présensibilisées par 5′ bromodéoxyuridine (BrdU) ou Hoechst 33342 avant l’irradiation UV. Bártová et al. 6 décrit précédemment l’étape presensitization, et récemment nous avons optimisé cette technique de microirradiation afin d’éviter la mort cellulaire ou apoptose. Par exemple, l’utilisation d’un laser UV de 405 nm (sans presensitization de Hoechst 33342) conduit à l’induction de cassures double brin de 53BP1 positif (CDB) au détriment des dimères de pyrimidine de cyclobutane (CPDs). En revanche, presensitization marches, combinés avec UV microirradiation induisent des niveaux très élevés de la CPDs et CDB simultanément7,8. Cette méthodologie est difficile à appliquer à l’étude d’une seule voie de réparation de l’ADN.
Avec microirradiation, il est possible d’analyser les protéines recrutement, cinétique et interaction aux lésions de l’ADN dans les cellules vivantes. Un exemple de cette méthode a été publié par Luijsterburg et al. 9 pour l’hétérochromatine protéine 1β et nous a montré récemment pour la première fois que le facteur de pluripotence Oct4 et une protéine associée aux corps de Cajal, coilin, sont recrutés à l’ADN par les rayons UV lésions6,10. Cinétique de protéines à ces lésions de l’ADN peuvent également être étudiés à l’aide de la PAF (récupération de Fluorescence après photoblanchiment)11,12,13 ou FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) techniques14 ,,15. Ces méthodes sont susceptibles de révéler la simple diffusion des protéines à des lésions de l’ADN ou des interactions protéine-protéine. Un outil utile pour une caractérisation plus poussée des protéines est FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) ou sa combinaison avec frette technologie (frette-FLIM)16. Ces méthodes permettent l’étude des processus en vivant des cellules qui sont stablement ou transitoirement exprimant la protéine d’intérêt marqué par une molécule fluorescente17. Ici, un exemple de temps de décroissance exponentielle (τ) pour la protéine p53 GFP-étiquetée et son partenaire d’interaction, mCherry-le tag 53BP1, jouant un rôle important dans l’ADN des dommages réponse18,19 est présenté. Le paramètre τ, la durée de vie du fluorochrome fourni par des calculs de FLIM, est spécifique pour une teinture de fluorescence donnée, ses capacités de liaison et son environnement cellulaire. Par conséquent, cette méthode peut nous montrer des distinctions entre les sous-populations de protéine, leurs capacités de liaison et leurs propriétés fonctionnelles après, par exemple, dommages à l’ADN.
Ici, un aperçu des approches méthodologiques des techniques de microscopie avancée utilisée dans notre laboratoire pour étudier le recrutement de protéines précis, cinétique, diffusion et interactions de protéine-protéine sur le site de la chromatine microirradiated est présenté. La méthode étape par étape pour l’induction des lésions locales d’ADN dans les cellules vivantes, ainsi qu’une description des méthodologies utiles pour l’étude des événements liés à l’ADN-dommages à localement induites lésions de l’ADN provoquées par les lasers UV sont fournis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Techniques de microscopie représentent des outils de base dans les laboratoires de recherche. Ici, une brève description des méthodes utilisées pour l’étude du recrutement de protéine et cinétique aux lésions de l’ADN est présentée. Nous avons particulièrement remarqué notre expérience expérimentale dans le domaine de la microirradiation locale des cellules vivantes, et nous discutons de l’étude de la cinétique de la protéine par interaction FRAP et protéine-protéine à des lésions de l’ADN pa…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par l’Agence de Grant de la République tchèque, projet P302-12-G157. Expériences aussi appuyés par le Programme CZ09 recherche de tchèque-norvégien, qui est supervisé par le fonds norvégiens et par le ministère de l’éducation, jeunesse et du Sport de la République tchèque (numéro de licence : 7F14369).
Materials
| Cell cultivation | |||
| HeLa | ATCC | CCL-2TM | |
| ES-D3 [D3] | ATCC | CRL-11632TM | |
| HeLa -Fucci cells | http://ruo.mbl.co.jp/bio/e/product/flprotein/fucci.html | ||
| DMEM | PAN-Biotech | P03-0710 | |
| DMEM high glucose | Sigma-Aldrich | D6429-500ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SV30180.03 | |
| ES Cell FBS | Gibco | 16141-079 | |
| Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Gibco | 11140-035 | |
| mLIF (mouse Leukemia Inhibitor Factor) | Merck Millipore | ESG1107 | |
| MTG (1-Thioglycerol) | Sigma-Aldrich | M6145-25ML | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Biosera | XC-A4122/100 | |
| Trypsin – EDTA | Biosera | XC-T1717/100 | dilute with 1 × PBS in ratio 1:6 |
| Nunclon cell culture dishes | Sigma-Aldrich | P7866 | cultivation of mESCs D3 cells |
| µ-Dish 35m+A15:I35m Grid-500 | Ibidi GmbH | 81166 | microscopic dish |
| 0.2% Gelatine | Sigma-Aldrich | G1890-100G | dilute in destille water and autoclaved |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell transfection | |||
| GFP-p53 plasmid | Addgene | 12091 | |
| mCherry-PCNA plasmid | generous gift from Cristina Cardoso, Technische Universität Darmstadt | ||
| mCherry-53BP1 plasmid | Addgene | 19835 | |
| Metafecetene | Biontex Laboratories GmbH | T020–2.0 | |
| 10 × PBS | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | for transfection use 1 × PBS diluted in nuclease-free water |
| 5-bromo-2’-deoxy-uridine | Sigma-Aldrich | 11296736001 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal microscopy | |||
| Microscope Leica TCS SP5 | Leica Microsystems | ||
| Microscope Leica TCS SP8 | Leica Microsystems | ||
| White-light laser | Leica Microsystems | ||
| 355-nm laser | Coherent Inc. | laser power 80 mW | |
| 405-nm laser | Leica Microsystems | laser power 50 mW | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunofluorescence staining | |||
| Coverslip | VWR International Ltd | 631-1580 | |
| 4% paraformaldehyde | Affymetrix | 19943 1 LT | |
| Triton X100 | MP Biomedicals | 2194854 | |
| Saponin from quillaja bark | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| 53BP1 | Abcam | ab21083 | primary antibody |
| AlexaFluore 647 | Thermo Fisher Scientific | A27040 | secondary antibody |
| Vectashield | Vector Laboratories Ltd | H-1000 | mounting medium |
Referências
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