Avanzate tecniche di microscopia confocale per studiare le interazioni proteina-proteina e cinetica alle lesioni del DNA
Summary
Microirradiation laser è uno strumento utile per gli studi della riparazione del DNA in cellule viventi. È indicato un approccio metodologico per l’utilizzo del laser UVA per indurre varie lesioni del DNA. Abbiamo ottimizzato un metodo per microirradiation locale che mantiene il normale ciclo cellulare; quindi, cellule irradiate procedono attraverso mitosi.
Abstract
Microirradiation locale con laser rappresenta uno strumento utile per gli studi del DNA-riparazione-processi in cellule vive. Qui, descriviamo un approccio metodologico per l’analisi cinetica della proteina alle lesioni del DNA nel corso del tempo o proteine interazioni su localmente microirradiated della cromatina. Mostriamo anche come riconoscere le singole fasi del ciclo cellulare usando il sistema cellulare di Fucci per studiare la cinetica di cellula-ciclo-dipendente della proteina alle lesioni del DNA. Una descrizione metodologica dell’uso di due laser UV (355 nm e 405 nm) per indurre diversi tipi di danno del DNA inoltre è presentata. Solo il microirradiated di cellule dal laser del diodo di 405 nanometro procedeva normalmente attraverso mitosi ed erano privi di dimeri di pirimidina cyclobutane (CPDs). Mostriamo anche come cellule di microirradiated possono essere risolto in un punto determinato momento per eseguire immunodetection di proteine endogene di interesse. Per gli studi di riparazione del DNA, descriviamo inoltre l’uso di metodi biofisici compreso FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) e FLIM (fluorescenza Lifetime Imaging microscopia) nelle cellule con spontaneamente d’avvenimento i fuochi di danni del DNA. Mostriamo anche un’applicazione di FLIM-FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) negli studi sperimentali delle interazioni proteina-proteina.
Introduction
Danno del DNA porta alla comparsa di lesioni del DNA che consiste della pirimidina del cyclobutane (CPDs), 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine e single-strand o double-strand breaks1,2. Γ-raggi sono la forma di radiazione ionizzante con la più alta energia e alta penetranza, così questa fonte di radiazione è ampiamente usata in radioterapia3. D’altra parte, sperimentalmente indotto danni al DNA causati da UV laser imita naturale esposizione ai raggi UV. Microirradiation UVA, come un metodo microscopico, rappresenta uno strumento sperimentale per lo studio di danno del DNA in cellule viventi individuali. Microirradiation è stato usato per la prima volta 40 anni fa per rivelare l’organizzazione delle regioni del cromosoma4,5. Questa tecnica è altamente dipendente le proprietà funzionali di microscopi confocali o i limiti tecnici di nanoscopia moderno. Per indurre lesioni del DNA, le cellule possono essere presensitized da 5′ bromodeossiuridina (BrdU) o Hoechst 33342 prima dell’irradiazione UV. Bártová et al. 6 precedentemente descritto il passo presensitization e recentemente abbiamo ottimizzato questa tecnica microirradiation al fine di evitare la morte cellulare o apoptosi. Ad esempio, l’uso di un laser UV 405 nm (senza Hoechst 33342 presensitization) porta all’induzione del doppio-filo di 53BP1-positivi (DSBs) a scapito di dimeri di pirimidina cyclobutane (CPDs). D’altra parte, presensitization passi combinati con UV microirradiation inducono livelli molto elevati di CPDs e DSBs contemporaneamente7,8. Questa metodologia è difficile da applicare allo studio di una singola via di riparazione del DNA.
Con microirradiation, è possibile analizzare l’assunzione di proteine, cinetica e interazione alle lesioni del DNA in cellule viventi. Un esempio di questo metodo è stato pubblicato da Luijsterburg et al. 9 per eterocromatina proteina 1 β e ci ha mostrato recentemente per la prima volta che il fattore di pluripotenza Oct4 e una proteina connessa con corpi di Cajal, coilina, sono reclutati per le lesioni del DNA indotto da UV6,10. Cinetica della proteina in queste lesioni del DNA possono anche essere studiati utilizzando il FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching)11,12,13 o FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) tecniche14 ,15. Questi metodi hanno il potenziale per rivelare semplice diffusione delle proteine alle lesioni del DNA o interazioni proteina-proteina. Uno strumento utile per ulteriore caratterizzazione delle proteine è FLIM (fluorescenza Lifetime Imaging microscopia) o la sua combinazione con FRET tecnologia (FRET-FLIM)16. Questi metodi consentono lo studio dei processi in cellule che sono stabilmente viventi o transitoriamente esprimenti la proteina di interesse contrassegnati da una molecola fluorescente17. Qui, è riportato un esempio del tempo di decadimento esponenziale (τ) per proteina GFP-etichettato p53 e il suo partner di interazione, mCherry-etichetta 53BP1, giocando un ruolo importante nel DNA danni risposta18,19 . Il parametro τ, la durata del fluorocromo fornito da calcoli di FLIM, è specifico per una tintura di fluorescenza determinata, le sue abilità di associazione e il suo ambiente cellulare. Pertanto, questo metodo può mostrarci distinzioni tra sottopopolazioni di proteina, le loro capacità di associazione e le loro proprietà funzionali dopo, ad esempio, il danno del DNA.
Qui, un contorno di approcci metodologici delle tecniche di microscopia avanzata che viene utilizzato nel nostro laboratorio per studiare il reclutamento di proteine specifiche del tempo, cinetica, diffusione e interazioni proteina-proteina nel sito della cromatina microirradiated è presentato. La metodologia dettagliata per l’induzione di lesioni locali del DNA in cellule viventi e una descrizione delle metodologie utili per studi di eventi relativi a DNA-danno alle lesioni del DNA localmente indotte causate da laser UV sono forniti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tecniche di microscopia rappresentano strumenti fondamentali in laboratori di ricerca. Qui, una breve descrizione dei metodi utilizzati per lo studio del reclutamento di proteine e cinetica alle lesioni del DNA è presentato. Abbiamo notato soprattutto la nostra esperienza sperimentale nel campo della locale microirradiation di cellule viventi, e discutiamo lo studio della cinetica della proteina di interazione proteina-proteina e FRAP alle lesioni del DNA di candeggio accettore FRET28 e sua avanz…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dall’Agenzia della Repubblica Ceca, progetto P302-12-G157 Grant. Esperimenti sono stati supportati anche dalla CZ09 di programma di ricerca ceco-norvegese, che è sorvegliato da fondi norvegesi e dal Ministero della pubblica istruzione, gioventù e Sport della Repubblica Ceca (concessione numero: 7F14369).
Materials
| Cell cultivation | |||
| HeLa | ATCC | CCL-2TM | |
| ES-D3 [D3] | ATCC | CRL-11632TM | |
| HeLa -Fucci cells | http://ruo.mbl.co.jp/bio/e/product/flprotein/fucci.html | ||
| DMEM | PAN-Biotech | P03-0710 | |
| DMEM high glucose | Sigma-Aldrich | D6429-500ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SV30180.03 | |
| ES Cell FBS | Gibco | 16141-079 | |
| Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Gibco | 11140-035 | |
| mLIF (mouse Leukemia Inhibitor Factor) | Merck Millipore | ESG1107 | |
| MTG (1-Thioglycerol) | Sigma-Aldrich | M6145-25ML | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Biosera | XC-A4122/100 | |
| Trypsin – EDTA | Biosera | XC-T1717/100 | dilute with 1 × PBS in ratio 1:6 |
| Nunclon cell culture dishes | Sigma-Aldrich | P7866 | cultivation of mESCs D3 cells |
| µ-Dish 35m+A15:I35m Grid-500 | Ibidi GmbH | 81166 | microscopic dish |
| 0.2% Gelatine | Sigma-Aldrich | G1890-100G | dilute in destille water and autoclaved |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell transfection | |||
| GFP-p53 plasmid | Addgene | 12091 | |
| mCherry-PCNA plasmid | generous gift from Cristina Cardoso, Technische Universität Darmstadt | ||
| mCherry-53BP1 plasmid | Addgene | 19835 | |
| Metafecetene | Biontex Laboratories GmbH | T020–2.0 | |
| 10 × PBS | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | for transfection use 1 × PBS diluted in nuclease-free water |
| 5-bromo-2’-deoxy-uridine | Sigma-Aldrich | 11296736001 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal microscopy | |||
| Microscope Leica TCS SP5 | Leica Microsystems | ||
| Microscope Leica TCS SP8 | Leica Microsystems | ||
| White-light laser | Leica Microsystems | ||
| 355-nm laser | Coherent Inc. | laser power 80 mW | |
| 405-nm laser | Leica Microsystems | laser power 50 mW | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunofluorescence staining | |||
| Coverslip | VWR International Ltd | 631-1580 | |
| 4% paraformaldehyde | Affymetrix | 19943 1 LT | |
| Triton X100 | MP Biomedicals | 2194854 | |
| Saponin from quillaja bark | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| 53BP1 | Abcam | ab21083 | primary antibody |
| AlexaFluore 647 | Thermo Fisher Scientific | A27040 | secondary antibody |
| Vectashield | Vector Laboratories Ltd | H-1000 | mounting medium |
Referências
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