Laser microirradiation is een nuttig instrument voor onderzoek naar DNA-herstel in levende cellen. Een methodologische aanpak voor het gebruik van UVA lasers voor het opwekken van verschillende DNA laesies wordt weergegeven. We hebben een methode voor het lokale microirradiation die de normale celcyclus; onderhoudt geoptimaliseerd zo doorloop bestraalde cellen mitose.
Lokale microirradiation met lasers vertegenwoordigt een nuttig instrument voor het onderzoek van DNA-reparatie-gerelateerde processen in levende cellen. Hier beschrijven we een methodologische aanpak bij de analyse van eiwit kinetiek op DNA laesies over tijd of eiwit-eiwit interacties op lokaal microirradiated chromatine. Ook laten we zien hoe te herkennen van de afzonderlijke fasen van de celcyclus met behulp van de Fucci cellulaire systeem te bestuderen van cel-cyclus-afhankelijk proteïne kinetiek op DNA laesies. Een methodologische beschrijving van het gebruik van twee UV lasers (355 nm en 405 nm) voor het opwekken van verschillende soorten DNA-beschadiging wordt ook gepresenteerd. Alleen de microirradiated van de cellen door de 405-nm diodelaser mitose normaal doorlopen en waren verstoken cyclobutaan pyrimidine-Dimeren (CPDs). Ook laten we zien hoe de microirradiated cellen kunnen worden opgelost op een bepaald tijdstip uit te voeren immunodetection van de endogene proteïnen van belang. Voor de DNA-reparatie studies, beschrijven we bovendien het gebruik van Biofysische methoden waaronder FRAP (fluorescentie herstel na Photobleaching) en FLIM (fluorescentie levensduur Imaging microscopie) in cellen met spontaan voorkomende DNA schade foci. We tonen ook een toepassing van de FLIM-FRET (fluorescentie Resonance Energy Transfer) in experimentele studies van eiwit-eiwitinteractie.
DNA-schade leidt tot de verschijning van DNA laesies bestaande uit cyclobutaan pyrimidine Dimeren (CPDs), 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine, en één-strand of dubbel-strand breekt1,2. Γ-straling zijn de vorm van ioniserende straling met de hoogste energie- en hoge doordringendheid, aldus deze bron van straling wordt wijd gebruikt in de radiotherapie3. Aan de andere kant, geïnduceerde experimenteel DNA-schade veroorzaakt door UV lasers nabootsers natuurlijke blootstelling aan UV-licht. UVA-microirradiation, vertegenwoordigt als een microscopische methode, een experimentele gereedschap voor de studie van DNA-beschadiging in individuele levende cellen. Microirradiation werd gebruikt voor de eerste maal 40 jaar geleden om te onthullen van de organisatie van chromosoom regio’s4,5. Deze techniek is sterk afhankelijk van of de functionele eigenschappen van de confocal microscopen of de technische grenzen van moderne nanoscopy. Om DNA laesies, kunnen cellen worden presensitized door 5′ bromodeoxyuridine (BrdU) of Hoechst 33342 voorafgaand aan UV bestraling. Bártová et al. 6 de presensitization stap voor het eerder beschreven, en onlangs we deze techniek microirradiation geoptimaliseerd teneinde celdood of apoptosis. Bijvoorbeeld leidt het gebruik van een laser UV 405-nm (zonder Hoechst 33342 presensitization) tot de inductie van 53BP1-positieve dubbel-strand einden (DSBs) ten koste van cyclobutaan pyrimidine-Dimeren (CPDs). Aan de andere kant, induceren presensitization stappen gecombineerd met UV microirradiation zeer hoge niveaus van de CPDs en DSBs tegelijk7,8. Deze methode is moeilijk toe te passen op de studie van een enkele DNA-reparatie-traject.
Met microirradiation is het mogelijk om te analyseren eiwit werving, kinetiek en interactie op DNA laesies in levende cellen. Een voorbeeld van deze methode werd gepubliceerd door Luijsterburg et al. 9 voor heterochromatin eiwit 1β, en we onlangs toonde voor de eerste keer dat de pluripotent factor Oct4 en een eiwit gekoppeld Cajal organen, coilin, worden gerekruteerd voor UV-geïnduceerde DNA laesies6,10. Eiwit kinetiek op deze DNA-letsels kunnen ook worden bestudeerd met behulp van de FRAP (fluorescentie herstel na Photobleaching)11,12,13 of FRET (fluorescentie Resonance Energy Transfer) technieken14 ,15. Deze methoden hebben het potentieel om te onthullen van eenvoudige verspreiding van eiwitten bij laesies van DNA of eiwit-eiwitinteractie. Een nuttig instrument voor extra karakterisatie van eiwitten is FLIM (fluorescentie levensduur Imaging microscopie) of de combinatie met FRET technologie (FRET-FLIM)16. Deze methoden kunnen de studie van de processen in levende cellen die stabiel of Transient uitdrukken van de proteïne van belang gelabeld door een fluorescerende molecuul17. Hier is een voorbeeld van exponentiële afname tijd (τ) voor GFP-gelabeld p53 proteïne en haar interactie partner, mCherry-tagged 53BP1, spelen een belangrijke rol in DNA schade antwoord18,19 weergegeven. De parameter τ, is de levensduur van de fluorescerende geboden door FLIM berekeningen, specifiek voor een bepaalde fluorescentie kleurstof, zijn bindende capaciteiten en zijn cellulaire omgeving. Dus, deze methode kan tonen ons onderscheid tussen eiwit subpopulaties, hun bindende capaciteiten en hun functionele eigenschappen na, bijvoorbeeld DNA-schade.
Hier een overzicht van de methodologische benaderingen van de geavanceerde microscopie technieken die wordt gebruikt in ons laboratorium voor tijd-specifieke eiwitten werving, kinetiek, verspreiding en eiwit-eiwitinteractie op de site van microirradiated chromatin studie wordt gepresenteerd. De stapsgewijze methode voor de inductie van lokale DNA laesies in levende cellen, en een beschrijving van de methoden die nuttig zijn voor onderzoek naar DNA-schade-gerelateerde evenementen op lokaal geïnduceerde DNA-beschadigingen veroorzaakt door UV lasers zijn beschikbaar.
Microscopie technieken vertegenwoordigen basishulpmiddelen in onderzoekslaboratoria. Hier een korte beschrijving van de methoden gebruikt voor de studie van eiwit werving en kinetiek op DNA laesies wordt gepresenteerd. Wij vooral bekend voor onze experimental ervaring op het gebied van lokale microirradiation van levende cellen, en we bespreken de studie van eiwit-kinetiek door FRAP en eiwit-eiwit interactie op DNA laesies door acceptor-bleken FRET28 en de geavanceerde wijziging FRET-FLIM (<strong…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gesteund door de subsidie-Agentschap van de Tsjechische Republiek, project P302-12-G157. Experimenten werden ook ondersteund door de Tsjechische-Noors onderzoek programma CZ09, die wordt begeleid door Noorse fondsen en door het ministerie van onderwijs, jeugd en Sport van de Tsjechische Republiek (verlenen van nummer: 7F14369).
Cell cultivation | |||
HeLa | ATCC | CCL-2TM | |
ES-D3 [D3] | ATCC | CRL-11632TM | |
HeLa -Fucci cells | http://ruo.mbl.co.jp/bio/e/product/flprotein/fucci.html | ||
DMEM | PAN-Biotech | P03-0710 | |
DMEM high glucose | Sigma-Aldrich | D6429-500ML | |
Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SV30180.03 | |
ES Cell FBS | Gibco | 16141-079 | |
Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Gibco | 11140-035 | |
mLIF (mouse Leukemia Inhibitor Factor) | Merck Millipore | ESG1107 | |
MTG (1-Thioglycerol) | Sigma-Aldrich | M6145-25ML | |
Penicillin-Streptomycin Solution | Biosera | XC-A4122/100 | |
Trypsin – EDTA | Biosera | XC-T1717/100 | dilute with 1 × PBS in ratio 1:6 |
Nunclon cell culture dishes | Sigma-Aldrich | P7866 | cultivation of mESCs D3 cells |
µ-Dish 35m+A15:I35m Grid-500 | Ibidi GmbH | 81166 | microscopic dish |
0.2% Gelatine | Sigma-Aldrich | G1890-100G | dilute in destille water and autoclaved |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cell transfection | |||
GFP-p53 plasmid | Addgene | 12091 | |
mCherry-PCNA plasmid | generous gift from Cristina Cardoso, Technische Universität Darmstadt | ||
mCherry-53BP1 plasmid | Addgene | 19835 | |
Metafecetene | Biontex Laboratories GmbH | T020–2.0 | |
10 × PBS | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | for transfection use 1 × PBS diluted in nuclease-free water |
5-bromo-2’-deoxy-uridine | Sigma-Aldrich | 11296736001 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Confocal microscopy | |||
Microscope Leica TCS SP5 | Leica Microsystems | ||
Microscope Leica TCS SP8 | Leica Microsystems | ||
White-light laser | Leica Microsystems | ||
355-nm laser | Coherent Inc. | laser power 80 mW | |
405-nm laser | Leica Microsystems | laser power 50 mW | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Immunofluorescence staining | |||
Coverslip | VWR International Ltd | 631-1580 | |
4% paraformaldehyde | Affymetrix | 19943 1 LT | |
Triton X100 | MP Biomedicals | 2194854 | |
Saponin from quillaja bark | Sigma-Aldrich | S4521 | |
BSA | Sigma-Aldrich | A2153 | |
53BP1 | Abcam | ab21083 | primary antibody |
AlexaFluore 647 | Thermo Fisher Scientific | A27040 | secondary antibody |
Vectashield | Vector Laboratories Ltd | H-1000 | mounting medium |