Summary

Geavanceerde confocale microscopie technieken om te studeren van eiwit-eiwitinteractie en kinetiek op DNA laesies

Published: November 12, 2017
doi:

Summary

Laser microirradiation is een nuttig instrument voor onderzoek naar DNA-herstel in levende cellen. Een methodologische aanpak voor het gebruik van UVA lasers voor het opwekken van verschillende DNA laesies wordt weergegeven. We hebben een methode voor het lokale microirradiation die de normale celcyclus; onderhoudt geoptimaliseerd zo doorloop bestraalde cellen mitose.

Abstract

Lokale microirradiation met lasers vertegenwoordigt een nuttig instrument voor het onderzoek van DNA-reparatie-gerelateerde processen in levende cellen. Hier beschrijven we een methodologische aanpak bij de analyse van eiwit kinetiek op DNA laesies over tijd of eiwit-eiwit interacties op lokaal microirradiated chromatine. Ook laten we zien hoe te herkennen van de afzonderlijke fasen van de celcyclus met behulp van de Fucci cellulaire systeem te bestuderen van cel-cyclus-afhankelijk proteïne kinetiek op DNA laesies. Een methodologische beschrijving van het gebruik van twee UV lasers (355 nm en 405 nm) voor het opwekken van verschillende soorten DNA-beschadiging wordt ook gepresenteerd. Alleen de microirradiated van de cellen door de 405-nm diodelaser mitose normaal doorlopen en waren verstoken cyclobutaan pyrimidine-Dimeren (CPDs). Ook laten we zien hoe de microirradiated cellen kunnen worden opgelost op een bepaald tijdstip uit te voeren immunodetection van de endogene proteïnen van belang. Voor de DNA-reparatie studies, beschrijven we bovendien het gebruik van Biofysische methoden waaronder FRAP (fluorescentie herstel na Photobleaching) en FLIM (fluorescentie levensduur Imaging microscopie) in cellen met spontaan voorkomende DNA schade foci. We tonen ook een toepassing van de FLIM-FRET (fluorescentie Resonance Energy Transfer) in experimentele studies van eiwit-eiwitinteractie.

Introduction

DNA-schade leidt tot de verschijning van DNA laesies bestaande uit cyclobutaan pyrimidine Dimeren (CPDs), 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine, en één-strand of dubbel-strand breekt1,2. Γ-straling zijn de vorm van ioniserende straling met de hoogste energie- en hoge doordringendheid, aldus deze bron van straling wordt wijd gebruikt in de radiotherapie3. Aan de andere kant, geïnduceerde experimenteel DNA-schade veroorzaakt door UV lasers nabootsers natuurlijke blootstelling aan UV-licht. UVA-microirradiation, vertegenwoordigt als een microscopische methode, een experimentele gereedschap voor de studie van DNA-beschadiging in individuele levende cellen. Microirradiation werd gebruikt voor de eerste maal 40 jaar geleden om te onthullen van de organisatie van chromosoom regio’s4,5. Deze techniek is sterk afhankelijk van of de functionele eigenschappen van de confocal microscopen of de technische grenzen van moderne nanoscopy. Om DNA laesies, kunnen cellen worden presensitized door 5′ bromodeoxyuridine (BrdU) of Hoechst 33342 voorafgaand aan UV bestraling. Bártová et al. 6 de presensitization stap voor het eerder beschreven, en onlangs we deze techniek microirradiation geoptimaliseerd teneinde celdood of apoptosis. Bijvoorbeeld leidt het gebruik van een laser UV 405-nm (zonder Hoechst 33342 presensitization) tot de inductie van 53BP1-positieve dubbel-strand einden (DSBs) ten koste van cyclobutaan pyrimidine-Dimeren (CPDs). Aan de andere kant, induceren presensitization stappen gecombineerd met UV microirradiation zeer hoge niveaus van de CPDs en DSBs tegelijk7,8. Deze methode is moeilijk toe te passen op de studie van een enkele DNA-reparatie-traject.

Met microirradiation is het mogelijk om te analyseren eiwit werving, kinetiek en interactie op DNA laesies in levende cellen. Een voorbeeld van deze methode werd gepubliceerd door Luijsterburg et al. 9 voor heterochromatin eiwit 1β, en we onlangs toonde voor de eerste keer dat de pluripotent factor Oct4 en een eiwit gekoppeld Cajal organen, coilin, worden gerekruteerd voor UV-geïnduceerde DNA laesies6,10. Eiwit kinetiek op deze DNA-letsels kunnen ook worden bestudeerd met behulp van de FRAP (fluorescentie herstel na Photobleaching)11,12,13 of FRET (fluorescentie Resonance Energy Transfer) technieken14 ,15. Deze methoden hebben het potentieel om te onthullen van eenvoudige verspreiding van eiwitten bij laesies van DNA of eiwit-eiwitinteractie. Een nuttig instrument voor extra karakterisatie van eiwitten is FLIM (fluorescentie levensduur Imaging microscopie) of de combinatie met FRET technologie (FRET-FLIM)16. Deze methoden kunnen de studie van de processen in levende cellen die stabiel of Transient uitdrukken van de proteïne van belang gelabeld door een fluorescerende molecuul17. Hier is een voorbeeld van exponentiële afname tijd (τ) voor GFP-gelabeld p53 proteïne en haar interactie partner, mCherry-tagged 53BP1, spelen een belangrijke rol in DNA schade antwoord18,19 weergegeven. De parameter τ, is de levensduur van de fluorescerende geboden door FLIM berekeningen, specifiek voor een bepaalde fluorescentie kleurstof, zijn bindende capaciteiten en zijn cellulaire omgeving. Dus, deze methode kan tonen ons onderscheid tussen eiwit subpopulaties, hun bindende capaciteiten en hun functionele eigenschappen na, bijvoorbeeld DNA-schade.

Hier een overzicht van de methodologische benaderingen van de geavanceerde microscopie technieken die wordt gebruikt in ons laboratorium voor tijd-specifieke eiwitten werving, kinetiek, verspreiding en eiwit-eiwitinteractie op de site van microirradiated chromatin studie wordt gepresenteerd. De stapsgewijze methode voor de inductie van lokale DNA laesies in levende cellen, en een beschrijving van de methoden die nuttig zijn voor onderzoek naar DNA-schade-gerelateerde evenementen op lokaal geïnduceerde DNA-beschadigingen veroorzaakt door UV lasers zijn beschikbaar.

Protocol

1. teelt van cellijnen HeLa-afgeleide cellijnen Opmerking: gebruik HeLa cellen van de cervicale carcinoom: beide HeLa cellen stabiel uiten Histon H2B gelabeld met GFP of HeLa-Fucci cellen uiten van RFP-Cdt1 in de G1 en vroege S fasen GFP-geminin in de S/G2-M fasen ( Figuur 1). Voor de teelt van alle HeLa-afgeleide cellijnen, gebruiken Dulbecco ' s bewerkt Eagle ' s medium (DMEM), aangevuld met 10% foetale runderserum en passende antibiotica …

Representative Results

Met behulp van geavanceerde confocale microscopie, zien we een accumulatie van mCherry-gelabeld 53BP1 en mCherry-PCNA eiwitten op DNA laesies. Analyses werden uitgevoerd door lokale microirradiation van levende cellen. Om te herkennen van de nucleaire distributiepatronen van DNA-reparatie-gerelateerde eiwitten in individuele celcyclus fasen, gebruikten we de cellulaire systeem van Fucci, waarmee het mogelijk is te bepalen de G1, de vroege S, en G2 fasen van de cel cyclus (<strong class="x…

Discussion

Microscopie technieken vertegenwoordigen basishulpmiddelen in onderzoekslaboratoria. Hier een korte beschrijving van de methoden gebruikt voor de studie van eiwit werving en kinetiek op DNA laesies wordt gepresenteerd. Wij vooral bekend voor onze experimental ervaring op het gebied van lokale microirradiation van levende cellen, en we bespreken de studie van eiwit-kinetiek door FRAP en eiwit-eiwit interactie op DNA laesies door acceptor-bleken FRET28 en de geavanceerde wijziging FRET-FLIM (<strong…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gesteund door de subsidie-Agentschap van de Tsjechische Republiek, project P302-12-G157. Experimenten werden ook ondersteund door de Tsjechische-Noors onderzoek programma CZ09, die wordt begeleid door Noorse fondsen en door het ministerie van onderwijs, jeugd en Sport van de Tsjechische Republiek (verlenen van nummer: 7F14369).

Materials

Cell cultivation
HeLa ATCC CCL-2TM
ES-D3 [D3] ATCC CRL-11632TM
HeLa -Fucci cells http://ruo.mbl.co.jp/bio/e/product/flprotein/fucci.html
DMEM PAN-Biotech P03-0710
DMEM high glucose Sigma-Aldrich D6429-500ML
Fetal bovine serum (FBS) HyClone SV30180.03
ES Cell FBS Gibco 16141-079
Non-Essential Amino Acids (NEAA) Gibco 11140-035
mLIF (mouse Leukemia Inhibitor Factor) Merck Millipore ESG1107
MTG (1-Thioglycerol) Sigma-Aldrich M6145-25ML
Penicillin-Streptomycin Solution Biosera XC-A4122/100
Trypsin – EDTA Biosera XC-T1717/100 dilute with 1 × PBS in ratio 1:6
Nunclon cell culture dishes Sigma-Aldrich P7866 cultivation of mESCs D3 cells
µ-Dish 35m+A15:I35m Grid-500 Ibidi GmbH 81166 microscopic dish
0.2% Gelatine Sigma-Aldrich G1890-100G dilute in destille water and autoclaved
Name Company Catalog Number Comments
Cell transfection
GFP-p53 plasmid Addgene 12091
mCherry-PCNA plasmid generous gift from Cristina Cardoso, Technische Universität Darmstadt
mCherry-53BP1 plasmid Addgene 19835
Metafecetene Biontex Laboratories GmbH T020–2.0
10 × PBS Thermo Fisher Scientific AM9625 for transfection use 1 × PBS diluted in nuclease-free water
5-bromo-2’-deoxy-uridine Sigma-Aldrich 11296736001
Name Company Catalog Number Comments
Confocal microscopy
Microscope Leica TCS SP5 Leica Microsystems
Microscope Leica TCS SP8 Leica Microsystems
White-light laser Leica Microsystems
355-nm laser Coherent Inc. laser power 80 mW
405-nm laser Leica Microsystems laser power 50 mW
Name Company Catalog Number Comments
Immunofluorescence staining
Coverslip VWR International Ltd 631-1580
4% paraformaldehyde Affymetrix 19943 1 LT
Triton X100 MP Biomedicals 2194854
Saponin from quillaja bark Sigma-Aldrich S4521
BSA Sigma-Aldrich A2153
53BP1 Abcam ab21083 primary antibody
AlexaFluore 647 Thermo Fisher Scientific A27040 secondary antibody
Vectashield Vector Laboratories Ltd H-1000 mounting medium

Referências

  1. Cadet, J., Mouret, S., Ravanat, J. L., Douki, T. Photoinduced damage to cellular DNA: direct and photosensitized reactions. Photochem Photobiol. 88 (5), 1048-1065 (2012).
  2. Cooke, M. S., et al. Immunochemical detection of UV-induced DNA damage and repair. J Immunol Methods. 280 (1-2), 125-133 (2003).
  3. Lahtz, C., et al. Gamma irradiation does not induce detectable changes in DNA methylation directly following exposure of human cells. PLoS One. 7 (9), e44858 (2012).
  4. Cremer, T., et al. Detection of chromosome aberrations in the human interphase nucleus by visualization of specific target DNAs with radioactive and non-radioactive in situ hybridization techniques: diagnosis of trisomy 18 with probe L1.84. Hum Genet. 74 (4), 346-352 (1986).
  5. Zorn, C., Cremer, T., Cremer, C., Zimmer, J. Laser UV microirradiation of interphase nuclei and post-treatment with caffeine. A new approach to establish the arrangement of interphase chromosomes. Hum Genet. 35 (1), 83-89 (1976).
  6. Bartova, E., et al. Recruitment of Oct4 protein to UV-damaged chromatin in embryonic stem cells. PLoS One. 6 (12), e27281 (2011).
  7. Stixova, L., et al. HP1beta-dependent recruitment of UBF1 to irradiated chromatin occurs simultaneously with CPDs. Epigenetics Chromatin. 7 (1), 39 (2014).
  8. Stixova, L., et al. Advanced microscopy techniques used for comparison of UVA- and gamma-irradiation-induced DNA damage in the cell nucleus and nucleolus. Folia Biol (Praha). 60, 76-84 (2014).
  9. Luijsterburg, M. S., et al. Heterochromatin protein 1 is recruited to various types of DNA damage. J Cell Biol. 185 (4), 577-586 (2009).
  10. Bartova, E., et al. Coilin is rapidly recruited to UVA-induced DNA lesions and gamma-radiation affects localized movement of Cajal bodies. Nucleus. 5 (3), 460-468 (2014).
  11. Franek, M., et al. Advanced Image Acquisition and Analytical Techniques for Studies of Living Cells and Tissue Sections. Microsc Microanal. 22 (2), 326-341 (2016).
  12. Lemmer, P., et al. Using conventional fluorescent markers for far-field fluorescence localization nanoscopy allows resolution in the 10-nm range. J Microsc. 235 (2), 163-171 (2009).
  13. Reits, E. A., Neefjes, J. J. From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells. Nat Cell Biol. 3 (6), E145-E147 (2001).
  14. Lakowitz, J. R. . Principles of Fluorescence Spectroscopy. , (2006).
  15. Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends Biochem Sci. 32 (9), 407-414 (2007).
  16. Levitt, J. A., Matthews, D. R., Ameer-Beg, S. M., Suhling, K. Fluorescence lifetime and polarization-resolved imaging in cell biology. Curr Opin Biotechnol. 20 (1), 28-36 (2009).
  17. Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. J Cell Comp Physiol. 59, 223-239 (1962).
  18. Iwabuchi, K., Bartel, P. L., Li, B., Marraccino, R., Fields, S. Two cellular proteins that bind to wild-type but not mutant p53. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (13), 6098-6102 (1994).
  19. Ward, I. M., Minn, K., van Deursen, J., Chen, J. p53 Binding protein 53BP1 is required for DNA damage responses and tumor suppression in mice. Mol Cell Biol. 23 (7), 2556-2563 (2003).
  20. Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Curr Biol. 8 (7), 377-385 (1998).
  21. Walter, J., Schermelleh, L., Cremer, M., Tashiro, S., Cremer, T. Chromosome order in HeLa cells changes during mitosis and early G1, but is stably maintained during subsequent interphase stages. J Cell Biol. 160 (5), 685-697 (2003).
  22. Sakaue-Sawano, A., et al. Tracing the silhouette of individual cells in S/G2/M phases with fluorescence. Chem Biol. 15 (12), 1243-1248 (2008).
  23. Sorokin, D. V., et al. Localized movement and morphology of UBF1-positive nucleolar regions are changed by gamma-irradiation in G2 phase of the cell cycle. Nucleus. 6 (4), 301-313 (2015).
  24. Vogel, S. S., Nguyen, T. A., van der Meer, B. W., Blank, P. S. The impact of heterogeneity and dark acceptor states on FRET: implications for using fluorescent protein donors and acceptors. PLoS One. 7 (11), e49593 (2012).
  25. Foltankova, V., Matula, P., Sorokin, D., Kozubek, S., Bartova, E. Hybrid detectors improved time-lapse confocal microscopy of PML and 53BP1 nuclear body colocalization in DNA lesions. Microsc Microanal. 19 (2), 360-369 (2013).
  26. Suchankova, J., et al. Distinct kinetics of DNA repair protein accumulation at DNA lesions and cell cycle-dependent formation of gammaH2AX- and NBS1-positive repair foci. Biol Cell. 107 (12), 440-454 (2015).
  27. Bártová, E., et al. PCNA is recruited to irradiated chromatin in late S phase and is most pronounced in G2 phase of the cell cycle. Protoplasma. , (2017).
  28. Krejci, J., et al. Post-Translational Modifications of Histones in Human Sperm. J Cell Biochem. 116 (10), 2195-2209 (2015).
  29. Chou, D. M., et al. A chromatin localization screen reveals poly (ADP ribose)-regulated recruitment of the repressive polycomb and NuRD complexes to sites of DNA damage. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (43), 18475-18480 (2010).
  30. Sustackova, G., et al. Acetylation-dependent nuclear arrangement and recruitment of BMI1 protein to UV-damaged chromatin. J Cell Physiol. 227 (5), 1838-1850 (2012).
  31. Smirnov, E., et al. Separation of replication and transcription domains in nucleoli. J Struct Biol. 188 (3), 259-266 (2014).
  32. Bastiaens, P. I., Squire, A. Fluorescence lifetime imaging microscopy: spatial resolution of biochemical processes in the cell. Trends Cell Biol. 9 (2), 48-52 (1999).
  33. Day, R. N. Measuring protein interactions using Forster resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy. Methods. 66 (2), 200-207 (2014).
  34. Konig, K., Uchugonova, A., Breunig, H. G. High-resolution multiphoton cryomicroscopy. Methods. 66 (2), 230-236 (2014).
check_url/pt/55999?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Legartová, S., Suchánková, J., Krejčí, J., Kovaříková, A., Bártová, E. Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions. J. Vis. Exp. (129), e55999, doi:10.3791/55999 (2017).

View Video