고급 단백질 단백질 상호 작용 및 DNA 병 변에서 속도 론 연구에 Confocal 현미경 검사 법 기술
Summary
레이저 microirradiation는 살아있는 세포에서 DNA 수리의 연구에 대 한 유용한 도구입니다. 다양 한 DNA 병 변 유발 하 UVA 레이저의 사용에 대 한 방법론 접근 표시 됩니다. 우리 지역 microirradiation; 정상적인 세포 주기를 유지 하는 방법을 최적화합니다 따라서, 비친된 세포 유사 분열을 통해 진행합니다.
Abstract
레이저와 로컬 microirradiation 라이브 세포에서 DNA 복구 관련 프로세스의 연구에 대 한 유용한 도구를 나타냅니다. 여기, 우리가 로컬로 microirradiated chromatin에서 시간 또는 단백질 단백질 상호 작용을 통해 단백질 DNA 병 변에서 활동을 분석 하는 방법론 접근 방식을 설명 합니다. 우리 또한 세포 주기 세포 주기 의존적인 단백질 DNA 병 변에서 속도 론을 공부 Fucci 셀룰러 시스템을 사용 하 여 개별 단계를 인식 하는 방법을 보여 줍니다. 2 자외선 레이저를 사용 하 여의 방법론 설명 (355 nm, 405 nm) 다른 유형의 DNA 손상 유도 하는 것 또한 제공 됩니다. 만 405 nm 다이오드 레이저 셀 microirradiated 유사 분열을 통해 정상적으로 진행 하 고 cyclobutane pyrimidine 이합체 (CPDs) 없는 했다. 우리는 또한 어떻게 microirradiated 셀 관심의 내 생 단백질의 immunodetection를 수행 하기 위해 주어진된 시간에 고쳐질 수 있다 보여줍니다. 또한 생물 방법 FRAP (복구 후 Photobleaching 형광) 및 FLIM (형광 일생 화상 현미경 검사 법)를 포함 하 여 자연 발생 된 셀에서의 사용 설명 DNA 수 선 연구, DNA 손상 포커스. 우리는 또한 단백질 단백질 상호 작용의 실험 연구에 FLIM-무서 워 (형광 공명 에너지 전송)의 응용 프로그램을 보여줍니다.
Introduction
구성 된 cyclobutane pyrimidine 이합체 (CPDs), 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine, 및 단일 가닥 DNA 변의 모양을 이끌어 DNA 손상 또는 더블-스트랜드 나누기1,2. Γ 광선은 높은 에너지와 높은 penetrance 이온화 방사선의 형태, 따라서 방사선의이 소스는 방사선 치료3에서 널리 이용 된다. 다른 한편으로, 실험적으로 UV 레이저 모방 자연 UV 빛에 노출으로 인 한 DNA 손상을 유도 한다. 현미경 방법으로 UVA microirradiation은 개별 살아있는 세포에서 DNA 손상 연구 실험 도구를 나타냅니다. Microirradiation은 염색체 지구4,5의 조직 공개 40 년 전에 처음으로 사용 되었다. 이 기술은 매우 중 confocal 현미경의 기능 특성 또는 현대 nanoscopy의 기술적인 한계에 종속 됩니다. DNA 병 변을 유도 하 세포 5′ bromodeoxyuridine (BrdU) 또는 Hoechst 33342 UV 조사 전에 presensitized 수 있습니다. Bártová 외. 6 이전 presensitization 단계를 설명 하 고 최근 우리 세포 죽음, 또는 apoptosis를 피하기 위하여이 microirradiation 기술에 최적화 된. 예를 들어 (Hoechst 33342 presensitization) 없이 405 nm 자외선 레이저를 사용 하 여 53BP1-긍정적인 이중 가닥 틈 (DSBs)의 유도 cyclobutane pyrimidine 이합체 (CPDs)의 비용으로 리드. 다른 한편으로, UV microirradiation와 함께 presensitization 단계 유도 CPDs과 DSBs의 매우 높은 수준을 동시에7,8. 이 방법은 단일 DNA 수 선 통로의 연구에 적용 하기가 어렵습니다.
Microirradiation, 단백질 모집, 활동, 및 살아있는 세포 병 변 DNA에서 상호 작용 분석 가능 하다. 이 방법의 예로 Luijsterburg 그 외 여러분 에 의해 출판 되었음 9 섬으로 단백질 1β, 그리고 우리에 대 한 최근 pluripotency 요소 Oct4 Cajal 몸, coilin와 관련 된 단백질 DNA UV 유도 된 병 변6,10모집은 처음으로 나타났다. 단백질이 DNA 병 변에서 활동 또한 FRAP (복구 후 Photobleaching 형광)11,,1213 를 사용 하 여 공부 될 수 있다 또는 (형광 공명 에너지 전송) 기술14 무서 워 ,15. 이러한 방법은 병 변 DNA 또는 단백질 단백질 상호 작용 단백질의 간단한 확산을 가능성이 있다. 단백질의 추가 특성에 대 한 유용한 도구가입니다 FLIM (형광 일생 화상 현미경) 또는 그것의 함께 무서 워 기술 (무서 워-FLIM)16. 이 메서드는 셀을 안정적으로 생활 또는 형광 분자17에 의해 표를 붙인 관심사의 단백질을 뚜렷이 표현 프로세스의 연구를 사용. 여기, GFP 태그 p53 단백질 및 그것의 상호 작용 협동자, mCherry 태그 53BP1, DNA 손상 응답18,19 에 있는 중요 한 역할에 대 한 지 수 감퇴 시간 (τ)의 예가 표시 됩니다. 매개 변수 τ FLIM 계산에서 제공 하는 형광 색소의 일생은 주어진된 형광 염료, 그것의 바인딩 능력 및 그것의 세포질 환경에 대 한 특정 이다. 따라서,이 방법은 표시할 수 있습니다 우리 단백질 부분 모집단, 그들의 바인딩 능력, 및 그들의 기능 속성 사이의 구분 후, 예를 들어 DNA 손상.
여기, 우리의 실험실에 시간 특정 단백질 모집, 속도 론, 확산, 및 microirradiated chromatin의 사이트에서 단백질 단백질 상호 작용을 공부 하는 데 사용 되는 고급 현미경 기술의 방법론 접근의 개요 제공 됩니다. 살아있는 세포에서 로컬 DNA 변의 유도 및 UV 레이저에 의해 발생 하는 로컬 유발된 DNA 병 변에서 DNA 손상 관련 이벤트의 연구에 대 한 유용한 방법론의 설명에 대 한 단계별 방법을 제공 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
현미경 검사 법 기술 연구 실험실에서 기본 도구를 나타냅니다. 여기, 단백질 모집의 연구에 대 한 사용 하는 방법에 대 한 간략 한 설명을 하 고 속도 론 DNA 병 변에서 선물 된다. 우리는 특히 살아있는 세포의 지역 microirradiation의 분야에서 우리의 실험 경험을 언급 하 고 우리가 FRAP 및 단백질-단백질 상호 작용 수락자 표백 무서 워28 에 의해 DNA 병 변 및 그것의 첨단에 의해 단백?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품의 체코 공화국, 프로젝트 P302-12-G157 부여 기관에 의해 지원 되었다. 실험 또한 체코 노르웨이어 연구 프로그램 CZ09, 노르웨이 자금, 그리고 교육, 청소년 및 스포츠의 체코 공화국에 의해 감독에 의해 지원 되었다 (허가 번호: 7F14369).
Materials
| Cell cultivation | |||
| HeLa | ATCC | CCL-2TM | |
| ES-D3 [D3] | ATCC | CRL-11632TM | |
| HeLa -Fucci cells | http://ruo.mbl.co.jp/bio/e/product/flprotein/fucci.html | ||
| DMEM | PAN-Biotech | P03-0710 | |
| DMEM high glucose | Sigma-Aldrich | D6429-500ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SV30180.03 | |
| ES Cell FBS | Gibco | 16141-079 | |
| Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Gibco | 11140-035 | |
| mLIF (mouse Leukemia Inhibitor Factor) | Merck Millipore | ESG1107 | |
| MTG (1-Thioglycerol) | Sigma-Aldrich | M6145-25ML | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Biosera | XC-A4122/100 | |
| Trypsin – EDTA | Biosera | XC-T1717/100 | dilute with 1 × PBS in ratio 1:6 |
| Nunclon cell culture dishes | Sigma-Aldrich | P7866 | cultivation of mESCs D3 cells |
| µ-Dish 35m+A15:I35m Grid-500 | Ibidi GmbH | 81166 | microscopic dish |
| 0.2% Gelatine | Sigma-Aldrich | G1890-100G | dilute in destille water and autoclaved |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell transfection | |||
| GFP-p53 plasmid | Addgene | 12091 | |
| mCherry-PCNA plasmid | generous gift from Cristina Cardoso, Technische Universität Darmstadt | ||
| mCherry-53BP1 plasmid | Addgene | 19835 | |
| Metafecetene | Biontex Laboratories GmbH | T020–2.0 | |
| 10 × PBS | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | for transfection use 1 × PBS diluted in nuclease-free water |
| 5-bromo-2’-deoxy-uridine | Sigma-Aldrich | 11296736001 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal microscopy | |||
| Microscope Leica TCS SP5 | Leica Microsystems | ||
| Microscope Leica TCS SP8 | Leica Microsystems | ||
| White-light laser | Leica Microsystems | ||
| 355-nm laser | Coherent Inc. | laser power 80 mW | |
| 405-nm laser | Leica Microsystems | laser power 50 mW | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunofluorescence staining | |||
| Coverslip | VWR International Ltd | 631-1580 | |
| 4% paraformaldehyde | Affymetrix | 19943 1 LT | |
| Triton X100 | MP Biomedicals | 2194854 | |
| Saponin from quillaja bark | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| 53BP1 | Abcam | ab21083 | primary antibody |
| AlexaFluore 647 | Thermo Fisher Scientific | A27040 | secondary antibody |
| Vectashield | Vector Laboratories Ltd | H-1000 | mounting medium |
Referências
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