Avançadas técnicas de microscopia Confocal para estudar interações da proteína-proteína e cinética de lesões do ADN
Summary
Microirradiation do laser é uma ferramenta útil para estudos de reparo de ADN em células vivas. Uma abordagem metodológica para o uso de lasers UVA para induzir várias lesões do ADN é mostrada. Otimizamos a um método para microirradiation local que mantém o ciclo celular normal; assim, as células irradiadas prosseguir através de mitose.
Abstract
Microirradiation local com lasers representa uma ferramenta útil para estudos de processos relacionados a reparação de DNA em células vivas. Aqui, descrevemos uma abordagem metodológica ao analisar a cinética de proteína de lesões do DNA sobre as interações de tempo ou da proteína-proteína na cromatina de microirradiated localmente. Também mostramos como reconhecer fases individuais do ciclo celular usando o sistema celular Fucci para estudar a cinética de proteína celular-ciclo-dependente de lesões do DNA. Uma descrição metodológica do uso de dois lasers UV (355 nm e 405 nm) induzir diferentes tipos de danos no DNA também é apresentada. Apenas a células microirradiated pelo laser diodo 405 nm transcorreu normalmente através de mitose e eram desprovidas de dímeros de pirimidina ciclobutano (CPDs). Também mostramos como células de microirradiated podem ser fixo em um ponto determinado tempo para realizar a immunodetection das proteínas endógenas de interesse. Para os estudos de reparação do ADN, adicionalmente descrevemos a utilização de métodos biofísicos, incluindo FRAP (recuperação de fluorescência após fotobranqueamento) e FLIM (Lifetime Imaging a microscopia de fluorescência) nas células com ocorrendo espontaneamente focos de dano do ADN. Mostramos também um aplicativo de FLIM-FRET (fluorescência ressonância transferência de energia) em estudos experimentais de interações da proteína-proteína.
Introduction
Danos ao DNA leva ao aparecimento de lesões de DNA consistindo de ciclobutano de dímeros de pirimidina (CPDs), 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine e single-strand ou dobro-Costa quebra1,2. Raios-γ são a forma de radiação ionizante, com a maior energia e alta penetrância, assim, esta fonte de radiação é amplamente utilizado em radioterapia3. Por outro lado, experimentalmente induzida por danos no DNA causados pela exposição aos raios UV imita lasers natural à luz UV. Microirradiation UVA, como um método microscópico, representa uma ferramenta experimental para estudar o dano de DNA em células vivas individuais. Microirradiation foi usado pela primeira vez há 40 anos a fim de revelar a organização do cromossomo regiões4,5. Esta técnica é altamente dependente ou as propriedades funcionais dos microscópios confocal ou os limites técnicos da nanoscopy moderna. Para induzir lesões do DNA, as células podem ser presensitized por 5′ bromodeoxyuridine (BrdU) ou Hoechst 33342 antes da irradiação UV. Bártová et al . 6 descrito anteriormente o passo presensitization, e recentemente nós aperfeiçoamos essa técnica de microirradiation para evitar a morte celular ou apoptose. Por exemplo, o uso de um laser UV de 405 nm (sem presensitization de Hoechst 33342) leva para a indução de 53BP1-positivo double-strand breaks (DSBs) em detrimento de dímeros de pirimidina ciclobutano (CPDs). Por outro lado, passos presensitization combinados com UV microirradiation induzem a níveis muito elevados de CPDs e DSBs simultaneamente7,8. Esta metodologia é difícil aplicar ao estudo de um único caminho de reparação do DNA.
Com microirradiation, é possível analisar o recrutamento de proteína, cinética e interação em lesões de DNA em células vivas. Um exemplo desse método foi publicado por Luijsterburg et al . 9 para 1 β proteína de heterocromatina e recentemente mostrou pela primeira vez que o fator de pluripotência Oct4 e uma proteína associada a corpos de Cajal, coilina, são recrutados para lesões de DNA induzida por UV6,10. Cinética de proteína destas lesões de DNA também podem ser estudadas usando o FRAP (recuperação de fluorescência após fotobranqueamento)11,12,13 ou FRET (transferência de energia fluorescência ressonância) técnicas14 ,15. Esses métodos têm o potencial para revelar a difusão simples de proteínas em lesões do ADN ou interações da proteína-proteína. Uma ferramenta útil para a caracterização adicional de proteínas é FLIM (Lifetime Imaging a microscopia de fluorescência) ou sua combinação com FRET tecnologia (FLIM-FRET)16. Estes métodos permitem o estudo dos processos de células que são estàvel vivas ou transitoriamente, expressando a proteína de interesse, marcado por uma molécula fluorescente17. Aqui, um exemplo de tempo de decaimento exponencial (τ) para proteína GFP-etiquetado p53 e seu parceiro de interação, mCherry-com a tag 53BP1, desempenhando um papel importante no DNA danos resposta18,19 é mostrado. O parâmetro τ, o tempo de vida do fluorocromo fornecido pelos cálculos FLIM, é específico para uma tinta determinada fluorescência, suas habilidades de ligação e seu ambiente celular. Portanto, esse método pode nos mostrar distinções entre subpopulações de proteína, suas habilidades de vinculação e suas propriedades funcionais após, por exemplo, danos ao DNA.
Aqui, um resumo das abordagens metodológicas das técnicas de microscopia avançada que é usado em nosso laboratório para estudar o recrutamento de tempo específico de proteína, cinética, difusão e interações da proteína-proteína no site da cromatina de microirradiated é apresentado. A metodologia passo a passo para a indução de lesões locais do DNA em células vivas e uma descrição das metodologias úteis para estudos de DNA danos relacionadas a eventos em lesões de DNA localmente induzidas causadas por lasers UV são fornecidos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Técnicas de microscopia representam ferramentas básicas em laboratórios de pesquisa. Aqui, uma breve descrição dos métodos utilizados para o estudo do recrutamento de proteína e cinética de lesões do ADN é apresentada. Observou-se especialmente nossa experiência experimental no campo da microirradiation local de células vivas, e discutimos o estudo da cinética de proteína por interação FRAP e da proteína-proteína em lesões do ADN por branqueamento aceitador FRET28 e sua avançad…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pela Agência da República Checa, projeto P302-12-G157 Grant. Experiências também apoiaram o Checo-Norueguês pesquisa programa CZ09, que é fiscalizado pelos fundos norueguês e pelo Ministério da educação, juventude e do desporto da República Checa (número de concessão: 7F14369).
Materials
| Cell cultivation | |||
| HeLa | ATCC | CCL-2TM | |
| ES-D3 [D3] | ATCC | CRL-11632TM | |
| HeLa -Fucci cells | http://ruo.mbl.co.jp/bio/e/product/flprotein/fucci.html | ||
| DMEM | PAN-Biotech | P03-0710 | |
| DMEM high glucose | Sigma-Aldrich | D6429-500ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SV30180.03 | |
| ES Cell FBS | Gibco | 16141-079 | |
| Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Gibco | 11140-035 | |
| mLIF (mouse Leukemia Inhibitor Factor) | Merck Millipore | ESG1107 | |
| MTG (1-Thioglycerol) | Sigma-Aldrich | M6145-25ML | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Biosera | XC-A4122/100 | |
| Trypsin – EDTA | Biosera | XC-T1717/100 | dilute with 1 × PBS in ratio 1:6 |
| Nunclon cell culture dishes | Sigma-Aldrich | P7866 | cultivation of mESCs D3 cells |
| µ-Dish 35m+A15:I35m Grid-500 | Ibidi GmbH | 81166 | microscopic dish |
| 0.2% Gelatine | Sigma-Aldrich | G1890-100G | dilute in destille water and autoclaved |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell transfection | |||
| GFP-p53 plasmid | Addgene | 12091 | |
| mCherry-PCNA plasmid | generous gift from Cristina Cardoso, Technische Universität Darmstadt | ||
| mCherry-53BP1 plasmid | Addgene | 19835 | |
| Metafecetene | Biontex Laboratories GmbH | T020–2.0 | |
| 10 × PBS | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | for transfection use 1 × PBS diluted in nuclease-free water |
| 5-bromo-2’-deoxy-uridine | Sigma-Aldrich | 11296736001 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal microscopy | |||
| Microscope Leica TCS SP5 | Leica Microsystems | ||
| Microscope Leica TCS SP8 | Leica Microsystems | ||
| White-light laser | Leica Microsystems | ||
| 355-nm laser | Coherent Inc. | laser power 80 mW | |
| 405-nm laser | Leica Microsystems | laser power 50 mW | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunofluorescence staining | |||
| Coverslip | VWR International Ltd | 631-1580 | |
| 4% paraformaldehyde | Affymetrix | 19943 1 LT | |
| Triton X100 | MP Biomedicals | 2194854 | |
| Saponin from quillaja bark | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| 53BP1 | Abcam | ab21083 | primary antibody |
| AlexaFluore 647 | Thermo Fisher Scientific | A27040 | secondary antibody |
| Vectashield | Vector Laboratories Ltd | H-1000 | mounting medium |
Referências
- Cadet, J., Mouret, S., Ravanat, J. L., Douki, T. Photoinduced damage to cellular DNA: direct and photosensitized reactions. Photochem Photobiol. 88 (5), 1048-1065 (2012).
- Cooke, M. S., et al. Immunochemical detection of UV-induced DNA damage and repair. J Immunol Methods. 280 (1-2), 125-133 (2003).
- Lahtz, C., et al. Gamma irradiation does not induce detectable changes in DNA methylation directly following exposure of human cells. PLoS One. 7 (9), e44858 (2012).
- Cremer, T., et al. Detection of chromosome aberrations in the human interphase nucleus by visualization of specific target DNAs with radioactive and non-radioactive in situ hybridization techniques: diagnosis of trisomy 18 with probe L1.84. Hum Genet. 74 (4), 346-352 (1986).
- Zorn, C., Cremer, T., Cremer, C., Zimmer, J. Laser UV microirradiation of interphase nuclei and post-treatment with caffeine. A new approach to establish the arrangement of interphase chromosomes. Hum Genet. 35 (1), 83-89 (1976).
- Bartova, E., et al. Recruitment of Oct4 protein to UV-damaged chromatin in embryonic stem cells. PLoS One. 6 (12), e27281 (2011).
- Stixova, L., et al. HP1beta-dependent recruitment of UBF1 to irradiated chromatin occurs simultaneously with CPDs. Epigenetics Chromatin. 7 (1), 39 (2014).
- Stixova, L., et al. Advanced microscopy techniques used for comparison of UVA- and gamma-irradiation-induced DNA damage in the cell nucleus and nucleolus. Folia Biol (Praha). 60, 76-84 (2014).
- Luijsterburg, M. S., et al. Heterochromatin protein 1 is recruited to various types of DNA damage. J Cell Biol. 185 (4), 577-586 (2009).
- Bartova, E., et al. Coilin is rapidly recruited to UVA-induced DNA lesions and gamma-radiation affects localized movement of Cajal bodies. Nucleus. 5 (3), 460-468 (2014).
- Franek, M., et al. Advanced Image Acquisition and Analytical Techniques for Studies of Living Cells and Tissue Sections. Microsc Microanal. 22 (2), 326-341 (2016).
- Lemmer, P., et al. Using conventional fluorescent markers for far-field fluorescence localization nanoscopy allows resolution in the 10-nm range. J Microsc. 235 (2), 163-171 (2009).
- Reits, E. A., Neefjes, J. J. From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells. Nat Cell Biol. 3 (6), E145-E147 (2001).
- Lakowitz, J. R. . Principles of Fluorescence Spectroscopy. , (2006).
- Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends Biochem Sci. 32 (9), 407-414 (2007).
- Levitt, J. A., Matthews, D. R., Ameer-Beg, S. M., Suhling, K. Fluorescence lifetime and polarization-resolved imaging in cell biology. Curr Opin Biotechnol. 20 (1), 28-36 (2009).
- Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. J Cell Comp Physiol. 59, 223-239 (1962).
- Iwabuchi, K., Bartel, P. L., Li, B., Marraccino, R., Fields, S. Two cellular proteins that bind to wild-type but not mutant p53. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (13), 6098-6102 (1994).
- Ward, I. M., Minn, K., van Deursen, J., Chen, J. p53 Binding protein 53BP1 is required for DNA damage responses and tumor suppression in mice. Mol Cell Biol. 23 (7), 2556-2563 (2003).
- Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Curr Biol. 8 (7), 377-385 (1998).
- Walter, J., Schermelleh, L., Cremer, M., Tashiro, S., Cremer, T. Chromosome order in HeLa cells changes during mitosis and early G1, but is stably maintained during subsequent interphase stages. J Cell Biol. 160 (5), 685-697 (2003).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Tracing the silhouette of individual cells in S/G2/M phases with fluorescence. Chem Biol. 15 (12), 1243-1248 (2008).
- Sorokin, D. V., et al. Localized movement and morphology of UBF1-positive nucleolar regions are changed by gamma-irradiation in G2 phase of the cell cycle. Nucleus. 6 (4), 301-313 (2015).
- Vogel, S. S., Nguyen, T. A., van der Meer, B. W., Blank, P. S. The impact of heterogeneity and dark acceptor states on FRET: implications for using fluorescent protein donors and acceptors. PLoS One. 7 (11), e49593 (2012).
- Foltankova, V., Matula, P., Sorokin, D., Kozubek, S., Bartova, E. Hybrid detectors improved time-lapse confocal microscopy of PML and 53BP1 nuclear body colocalization in DNA lesions. Microsc Microanal. 19 (2), 360-369 (2013).
- Suchankova, J., et al. Distinct kinetics of DNA repair protein accumulation at DNA lesions and cell cycle-dependent formation of gammaH2AX- and NBS1-positive repair foci. Biol Cell. 107 (12), 440-454 (2015).
- Bártová, E., et al. PCNA is recruited to irradiated chromatin in late S phase and is most pronounced in G2 phase of the cell cycle. Protoplasma. , (2017).
- Krejci, J., et al. Post-Translational Modifications of Histones in Human Sperm. J Cell Biochem. 116 (10), 2195-2209 (2015).
- Chou, D. M., et al. A chromatin localization screen reveals poly (ADP ribose)-regulated recruitment of the repressive polycomb and NuRD complexes to sites of DNA damage. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (43), 18475-18480 (2010).
- Sustackova, G., et al. Acetylation-dependent nuclear arrangement and recruitment of BMI1 protein to UV-damaged chromatin. J Cell Physiol. 227 (5), 1838-1850 (2012).
- Smirnov, E., et al. Separation of replication and transcription domains in nucleoli. J Struct Biol. 188 (3), 259-266 (2014).
- Bastiaens, P. I., Squire, A. Fluorescence lifetime imaging microscopy: spatial resolution of biochemical processes in the cell. Trends Cell Biol. 9 (2), 48-52 (1999).
- Day, R. N. Measuring protein interactions using Forster resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy. Methods. 66 (2), 200-207 (2014).
- Konig, K., Uchugonova, A., Breunig, H. G. High-resolution multiphoton cryomicroscopy. Methods. 66 (2), 230-236 (2014).
