Avanzadas técnicas de Microscopía Confocal para estudiar las interacciones proteína-proteína y cinética en las lesiones del ADN
Summary
Microirradiation láser es una herramienta útil para estudios de reparación del ADN en las células vivas. Se muestra un enfoque metodológico para el uso de láseres de rayos UVA para inducir varias lesiones del ADN. Hemos optimizado un método para microirradiation local que mantiene el ciclo normal de la célula; así, las células irradiadas proceden a través de mitosis.
Abstract
Microirradiation local con láser representa una herramienta útil para estudios de procesos relacionados con la reparación de DNA en células vivas. Aquí, describimos un enfoque metodológico para el análisis de la cinética de la proteína en las lesiones del ADN sobre interacciones proteína-proteína o tiempo en localmente microirradiated cromatina. También nos enseña a reconocer las fases individuales del ciclo celular utilizando el sistema celular Fucci para estudiar la cinética de la proteína dependiente de ciclo celular en las lesiones del ADN. Una descripción metodológica de la utilización de dos láseres UV (355 nanómetro y 405 nm) inducir diferentes tipos de daño de la DNA también se presenta. Sólo el microirradiated de las células por el láser de 405 nm diodo procedió normalmente a través de la mitosis y se desprovisto de dímeros de pirimidina ciclobutano (CPDs). También mostramos cómo las células de microirradiated pueden ser fijo en un momento dado para llevar a cabo la inmunodetección de proteínas endógenas de interés. Para los estudios de reparación de ADN, además se describe el uso de métodos biofísicos como FRAP (recuperación de fluorescencia Tras Fotoblanqueo) FLIM (vida proyección de imagen de microscopía de fluorescencia) en las células con que se producen espontáneamente focos de daño de ADN. También se muestra una aplicación de FLIM-FRET (energía de resonancia de la fluorescencia transferencia) en los estudios experimentales de las interacciones proteína-proteína.
Introduction
Daños en el ADN conduce a la aparición de las lesiones del ADN de dímeros de pirimidina ciclobutano (CPDs), 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine y sola o doble cadena rompe1,2. Los rayos γ son la forma de radiaciones ionizantes con la más alta energía y alta penetrancia, así esta fuente de radiación es ampliamente utilizada en radioterapia3. Por otro lado, experimentalmente inducida por daño en el ADN causada por lásers imitadores naturales la exposición Ultravioleta a los rayos UV. Microirradiation UVA, como un método microscópico, representa una herramienta experimental para el estudio de daño de la DNA en células vivas individuales. Microirradiation fue utilizado por primera vez hace 40 años para revelar la organización del cromosoma regiones4,5. Esta técnica es altamente dependiente de cualquiera de las propiedades funcionales de microscopios confocales o los límites técnicos de nanoscopía moderno. Para inducir las lesiones del ADN, las células pueden ser presensitized por 5′ bromodeoxiuridina (BrdU) o Hoechst 33342 antes de la irradiación UV. Bártová et al. 6 había descrito anteriormente el paso presensitization, y recientemente hemos optimizado esta técnica de microirradiation para evitar la muerte celular o apoptosis. Por ejemplo, el uso de un láser UV de 405 nm (sin presensitization de Hoechst 33342) conduce a la inducción de roturas de doble cadena 53BP1 positivo (distritales) a expensas de dímeros de pirimidina ciclobutano (CPDs). Por otro lado, pasos presensitization combinados con microirradiation UV inducen niveles muy altos de CPDs y distritales simultáneamente7,8. Esta metodología es difícil de aplicar al estudio de una sola vía de reparación de ADN.
Con microirradiation, es posible analizar el reclutamiento de proteínas, cinética y la interacción en las lesiones del ADN en las células vivas. Un ejemplo de este método fue publicado por Luijsterburg et al. 9 1β de proteína de la heterocromatina, y recientemente se demostró para la primera vez que los factores de pluripotencia Oct4 y una proteína vinculada con los cuerpos de Cajal, coilina, son reclutados al ADN inducido por UV lesiones6,10. Cinética de la proteína en estas lesiones de ADN también pueden ser estudiadas usando el FRAP (recuperación de fluorescencia Tras Fotoblanqueo)11,12,13 o traste técnicas (energía de resonancia de la fluorescencia transferencia)14 ,15. Estos métodos tienen el potencial para revelar la simple difusión de proteínas en las lesiones del ADN o las interacciones proteína-proteína. Una herramienta útil para la caracterización adicional de las proteínas es FLIM (vida proyección de imagen de microscopía de fluorescencia) o su combinación con FRET tecnología (FLIM-FRET)16. Estos métodos permiten el estudio de los procesos en la vida las células que son estable o transitorio expresando la proteína de interés con la etiqueta por una molécula fluorescente17. Aquí, se muestra un ejemplo de decaimiento exponencial de tiempo (τ) para proteína p53 tagged GFP y su socio de la interacción, etiquetado mCherry 53BP1, desempeñando un papel importante en el daño de ADN respuesta18,19 . El parámetro τ, la vida útil del fluorocromo proporcionado por cálculos del FLIM, es específico para un colorante de fluorescencia dado, sus capacidades de Unión y su entorno celular. Por lo tanto, este método puede nos muestran diferencias entre subpoblaciones de la proteína, sus habilidades de enlace y sus propiedades funcionales después de, por ejemplo, daños en el ADN.
Aquí, un resumen de los enfoques metodológicos de las técnicas de microscopía avanzada que se utiliza en nuestro laboratorio para estudiar el reclutamiento de proteínas específicos, cinética, difusión y las interacciones de la proteína-proteína en el sitio de la cromatina microirradiated se presenta. La metodología paso a paso para la inducción de lesiones locales del ADN en las células vivas y una descripción de las metodologías útiles para estudios de eventos relacionados con el daño de DNA en lesiones de ADN localmente inducidas causadas por láseres UV son proporcionados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Técnicas de microscopía representan herramientas básicas en laboratorios de investigación. Aquí, una breve descripción de los métodos utilizados para el estudio de reclutamiento de la proteína y se presenta la cinética en las lesiones del ADN. Destaca especialmente la experiencia experimental en el campo de la microirradiation local de las células vivas, y discutimos el estudio de la cinética de la proteína por interacción proteína-proteína y FRAP en las lesiones del ADN por blanqueo de aceptador traste<su…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por la Agencia de donación de la República Checa, proyecto P302-12-G157. Los experimentos también fueron apoyados por la CZ09 de programa de investigación Checa-Noruega, que es supervisado por los fondos noruegos y por el Ministerio de educación, juventud y deporte de la República Checa (número: 7F14369).
Materials
| Cell cultivation | |||
| HeLa | ATCC | CCL-2TM | |
| ES-D3 [D3] | ATCC | CRL-11632TM | |
| HeLa -Fucci cells | http://ruo.mbl.co.jp/bio/e/product/flprotein/fucci.html | ||
| DMEM | PAN-Biotech | P03-0710 | |
| DMEM high glucose | Sigma-Aldrich | D6429-500ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SV30180.03 | |
| ES Cell FBS | Gibco | 16141-079 | |
| Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Gibco | 11140-035 | |
| mLIF (mouse Leukemia Inhibitor Factor) | Merck Millipore | ESG1107 | |
| MTG (1-Thioglycerol) | Sigma-Aldrich | M6145-25ML | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Biosera | XC-A4122/100 | |
| Trypsin – EDTA | Biosera | XC-T1717/100 | dilute with 1 × PBS in ratio 1:6 |
| Nunclon cell culture dishes | Sigma-Aldrich | P7866 | cultivation of mESCs D3 cells |
| µ-Dish 35m+A15:I35m Grid-500 | Ibidi GmbH | 81166 | microscopic dish |
| 0.2% Gelatine | Sigma-Aldrich | G1890-100G | dilute in destille water and autoclaved |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell transfection | |||
| GFP-p53 plasmid | Addgene | 12091 | |
| mCherry-PCNA plasmid | generous gift from Cristina Cardoso, Technische Universität Darmstadt | ||
| mCherry-53BP1 plasmid | Addgene | 19835 | |
| Metafecetene | Biontex Laboratories GmbH | T020–2.0 | |
| 10 × PBS | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | for transfection use 1 × PBS diluted in nuclease-free water |
| 5-bromo-2’-deoxy-uridine | Sigma-Aldrich | 11296736001 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal microscopy | |||
| Microscope Leica TCS SP5 | Leica Microsystems | ||
| Microscope Leica TCS SP8 | Leica Microsystems | ||
| White-light laser | Leica Microsystems | ||
| 355-nm laser | Coherent Inc. | laser power 80 mW | |
| 405-nm laser | Leica Microsystems | laser power 50 mW | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunofluorescence staining | |||
| Coverslip | VWR International Ltd | 631-1580 | |
| 4% paraformaldehyde | Affymetrix | 19943 1 LT | |
| Triton X100 | MP Biomedicals | 2194854 | |
| Saponin from quillaja bark | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| 53BP1 | Abcam | ab21083 | primary antibody |
| AlexaFluore 647 | Thermo Fisher Scientific | A27040 | secondary antibody |
| Vectashield | Vector Laboratories Ltd | H-1000 | mounting medium |
Referências
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