Descrevemos um protocolo para a realização de hepatectomy parcial (PHx) e transplante de células através do baço em NOD. SCID (ASSENTIMENTO. CB17-Prkdcscid/J) ratos. Neste protocolo, uma incisão é feita para expor e fazer a ressecção do lobo esquerdo do fígado seguido por outra incisão para o transplante intrasplenic de células.
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Artigo de método
Intrasplenic transplante de hepatócitos após Hepatectomy parcial na NOD. Ratos SCID
Neste artigo
Resumo
Resumo
Hepatectomy parcial é um método versátil e pode ser reproduzido para estudar a regeneração hepática e o efeito da terapêutica de célula com base em várias condições patológicas. Hepatectomy parcial também facilita a enxertia aumentada e proliferação das células transplantadas por neovascularização acelerada e migração de células para o fígado. Aqui, descrevemos um protocolo simples para executar hepatectomy 30% e o transplante de células no baço de um não-obesos diabéticos/grave combinado NOD imunodeficientes. SCID (ASSENTIMENTO. CB17-Prkdcscid/J) rato.
Neste procedimento, são feitas duas pequenas incisões. A primeira incisão é expor e fazer a ressecção do lobo esquerdo do fígado, e outra pequena incisão para expor o baço para o transplante intrasplenic de células. Este procedimento não requer nenhuma habilidade cirúrgica especializada, e pode ser completado em 5-7 minutos com menos estresse e dor, recuperação mais rápida e melhor sobrevivência. Nós demonstramos que o transplante de hepatócitos isolados de uma proteína verde fluorescente (GFP), expressando o rato (transgénico C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J), bem como hepatócito como células de origem humana (NeoHep) em parcialmente hepatectomized NOD. Ratos SCID.
Introdução
Atualmente, transplante de hepatócitos é proposto como uma alternativa ao transplante de órgão inteiro para tratar pacientes com distúrbios hepáticos graves. Acredita-se que ele pode ponte pacientes de transplante de órgão inteiro1. Além dos hepatócitos alogênico2, hepatócitos xenogénica3 e hepatócitos derivados de células-tronco4 também estão sendo investigados em modelos animais. Neste contexto, a orientação e enxertia potencial das células transplantadas no receptor é um critério importante para a terapia de célula com base na insuficiência hepática aguda (AHF).
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Protocolo
Os procedimentos apresentados neste protocolo foram aprovados pelo Comitê de ética institucional Animal do Instituto Nacional de Imunologia, Nova Deli. O número de série de referência da aprovação é IAEC #319/13.
Nota: Existem excelentes recursos em procedimentos de cirurgia geral20 e protocolos específicos para a cirurgia do roedor21. Para aqueles que fazem a cirurgia animal pela primeira vez, é aconselhável extensivamente em prática procedimentos cirúrgicos em bonecos antes de operar em animais.
1. preparação
- Antes do experimento, manter estéril....
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Resultados
Proliferação hepatocyte após hepatectomy parcial de 30%: A proliferação dos hepatócitos nos restantes fígada após 30% hepatectomy foi examinada por imuno-histoquímica (IHC) mancha para um marcador de proliferação celular, Ki-67. Post um dia hepatectomy, os ratos foram sacrificados, os lóbulos de fígado restantes foram extirpados e cortes de parafina foram obtidos. As seções foram coradas com anticorpo Ki-67, seguido de rotulagem com anticorpo secundário conjugado de horseradish peroxidase (HRP). Di-Amino.......
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Discussão
Hepatectomy parcial é uma técnica estabelecida para investigar regeneração hepática e hepatectomy excessiva é relatado para imitar o modelo de AHF. Entre modelos animais de AHF, roedores, sobretudo ratos, são o modelo mais pesquisado. Para obter um modelo de lesão hepática em ratos, até um 70% hepatectomy tem sido relatado com uma taxa de sobrevivência bom25,26. No entanto em nude e outro rato imunodeficientes, um hepatectomy 70% foi relatado como fatal e animais.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pela subvenção núcleo recebida do departamento de biotecnologia, governo da Índia para o Instituto Nacional de Imunologia, Nova Deli. Endereço atual do Dr. Bhattacharjee é a divisão de Gastroenterologia, Hepatologia e nutrição, Hospital Los Angeles das crianças.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Sistema de Anestesia a Gás | Ugo Basile; Itália | 211000 | |
| Máquina de pesagem | Goldtech ; Gabinete | compras locais | |
| (Classe I) | Kartos internacional; Aparador | de compras locais | |
| , Panasonic; Japão | ER-GY10 | ||
| Tesoura de operação reta com lâminas afiadas / afiadas | Major Surgicals; | de Compras Locais | |
| com Serrilhas | Principais Cirúrgicas; Compras locais da Índia | ||
| Porta-agulhas micro reto e curvo | Mércia; Inglaterra | BS-13-8 | |
| Seringa de insulina de 1 ml com 30G *5/16 agulhas | Dispo Van; Índia | ||
| Seringa de 1 ml com 26 G * 1/2 agulha | BD; EUA | REF 303060 | |
| Fios de Nylon | poderoso; Índia | (1-0) Aquisição Local | |
| MERSUTURES 4-0 Sutura Agulhada Cirúrgica Esterilizada | Ethicon, Johnson & Johnson, Índia | NW 5047 | |
| TRUGUT 76 cm 4-0 sutura cirúrgica absorvível | Suturas Índia Pvt. Ltd; Índia | SN 5048 | Sutura Agulhada Cirúrgica Esterilizada Catgut Cotonetes Puros |
| Cotonetes Pvt Ltd; Fita | Compras Locais | ||
| 3M Índia ; Índia | 1530-1 | Micropore Surgical Tape Microtome | |
| Histo-Line Laboratories, Itália | MRS3500 | ||
| Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation; Microscópio | ||
| Carl Zeiss; Alemanha | LSM 510 META | ||
| Microscópio de Campo Brilhante | Olympus, Japão | LX51 | |
| Analisador automatizado | Tulip, Alto Santracruz, Índia | Screen Maaster 3000 | Analisador bioquímico para teste funcional hepático |
| Citômetro de fluxo | BD ; EUA | BD FACSverse | Avaliação da presença de células pós-transplante |
| Creme de depilação Veet | Reckitt Benckiser, Índia | ||
| FORANE | Abbott; Isoflurano dos EUA | USP 99,9% | |
| Taxim | AlKem; Injeção de | cefotaxima sódica | |
| Solução de iodo-povidona | Vitória-Medicare; Índia | Betadine | |
| Paraformaldeído | Himedia; Índia | GRM 3660 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Life technologies, Thermo Fisher científico; US | 12200-036 | |
| Sacarose | Sigma; US | S0389 | |
| Tecido-Tek | Sakura; US | 25608-930 | O.C.T composto |
| DAPI | Himedia; Índia | MB 097 | |
| anti-albumina de cabra Polyclonal | Thermo Scientific, Pierce, US | PA126081 | |
| anti-conexina 32/GJB1 Polyclonal | abcam, UK | ab64609-500 | |
| antiGFP coelho policlonal | biotecnologia Santa Cruz; US | SC 8334 | |
| Alexa Fluor 594 burro anti-cabra | Sondas Moleculares, Thermo Fisher Scientific; US | A11058 | |
| Alexa Fluor 488 burro anti-ovelha | Sondas Moleculares, Thermo Fisher Scientific; US | A11015 | |
| Alexa Fluor 594 frango anti coelho | Sondas Moleculares, Thermo Fisher Scientific; US | A21442 | |
| Cabra anti coelho IgG HRP | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific; EUA | 65-6120 | |
| anticorpo anti-Ki67 | abcam, Reino Unido | ab15580 | |
| Solução de desmascaramento de antígeno, base de ácido cítrico | Laboratórios de vetores, US | H-3300 | |
| ProLong Diamond mountant antifade | Life technologies, Thermo Fisher científico; US | P36966 | |
| KIT SGOT (ASAT) | Sistema Clínico de Coral, Índia | ||
| SGPT (ALAT) KIT | Sistema Clínico de Coral, Kit | ||
| (DEA) | Sistema Clínico de Coral, Solução de | ||
| de Mayer | ; US | MHS16 | |
| Eosin Y solução, álcool | Sigma ; Montagem DPX HT110132 | ||
| sigma; US | 6522 | ||
| Melonex (analgésico) | Intas Pharmaceuticals Ltd; Índia | Injeção de meloxicam | |
| Sistema de substrato líquido aprimorado DAB tetracloridrato | Sigma ; E.U. | D3939 |
Referências
- Nussler, A., et al. Present status and perspectives of cell-based therapies for liver diseases. J. Hepatol. 45 (1), 144-159 (2006).
- Ponder, K. P., et al. Mouse hepatocytes migrate to liver parenchyma and f....
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Reimpressões e permissões
