Summary
Wir haben ein Protokoll für die Durchführung von teilweise Hepatektomie (PHx) und Zelltransplantation über Milz in NOD beschrieben. SCID (NICKEN. CB17-Prkdcscidj) Mäuse. In diesem Protokoll wird ein Einschnitt gemacht, zu entlarven und den linken Leberlappen folgte ein weiterer Einschnitt für die intrasplenic Transplantation von Zellen zu resezieren.
Abstract
Teilweise Hepatektomie ist eine vielseitige und reproduzierbare Methode zur Leberregeneration und die Wirkung von zellbasierten Therapie in verschiedenen pathologischen Bedingungen zu studieren. Partielle Hepatektomie erleichtert auch die erhöhte Engraftment und Proliferation von transplantierten Zellen durch beschleunigte Neovaskularisation und Zellwanderung auf der Leber. Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll für immungeschwächte NOD 30 % Hepatektomie und Transplantation von Zellen in der Milz ein nicht adipösen Diabetiker/schwere Ausführung kombiniert werden. SCID (NICKEN. CB17-Prkdcscidj) Maus.
Bei diesem Verfahren werden zwei kleine Hautschnitte vorgenommen. Der erste Schnitt ist zu entlarven und den linken Leberlappen resezieren, und ein weiterer kleiner Schnitt erfolgt, die Milz für die intrasplenic Transplantation von Zellen verfügbar zu machen. Dieses Verfahren erfordert keine speziellen chirurgische Fähigkeiten nicht, und es kann in ca. 5-7 Minuten mit weniger Stress und Schmerzen, schnellere Genesung und bessere Überlebensrate abgeschlossen werden. Wir haben die Transplantation von Leberzellen isoliert von einem grün fluoreszierendes Protein (GFP) mit dem Ausdruck ihrer Maus (transgene C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J) sowie Hepatozyten wie Zellen menschlichen Ursprungs (NeoHep) in teilweise Hepatectomized NOD bewiesen. SCID-Mäuse.
Introduction
Als Alternative zur gesamten Organ-Transplantation zur Behandlung von Patienten mit schweren Lebererkrankungen wird derzeit Hepatozyten Transplantation vorgeschlagen. Es wird vermutet, dass es Patienten auf ganze Organ Transplantation1überbrücken kann. Neben der allogenen Hepatozyten2werden xenogenen Hepatozyten3 und Hepatozyten abgeleitet von Stammzellen4 auch in Tiermodellen untersucht. In diesem Zusammenhang, das Homing und Engraftment ist Potenzial der transplantierten Zellen des Empfängers ein wichtiges Kriterium für zellbasierte Therapie im akuten Leberversagen (AHF).
Für die Untersuchung der Transplantation von Leberzellen oder Hepatozyten-wie Zellen5, entsteht AHF in einem Tiermodell durch chirurgische6 oder pharmakologische7 Verfahren durch die Transplantation von Zellen. Zu Tiermodell AHF durch pharmakologische Reagenzien, viele Hepatotoxins wie Paracetamol9, Carbon Titantetrachlorid10, Thioacetamide11, d-Galactosamin8, Concanavalin A12, Lipopolysaccharid13 , etc.., verwendet wurden. Aus dieser Liste jedes Reagenz erzeugt einen eindeutigen Satz von Funktionen für AHF, aber leider keinen einzigen Reagenz imitiert menschliche AHF. Darüber hinaus die AHF induziert durch Hepatotoxins dauert eine lange Zeit, die Tiere unter Dauerstress setzt, und reproduzierbare Ergebnisse sind schwer zu bekommen.
Auf der anderen Seite die chirurgische Verfahren der partiellen Hepatektomie (PHx) ist Geschick abhängig, und reproduzierbare Ergebnisse sind leicht zu beschaffen, nach der Entwicklung der erforderlichen Fähigkeiten. AHF durch einen chirurgischen Eingriff allein zu induzieren, ist die Resektion von mehr als 70 % der Leber erforderlich; jedoch verpflanzt weniger als eine 70 % Hepatektomie noch genutzt werden kann, um Studie Engraftment und Proliferation von Zellen in der Leber für die Analyse ihrer therapeutischen Kapazität bei Leberschäden14. Die Transplantation von Leberzellen wurden durchgeführt Post Hepatektomie durch das Peritoneum15, Tail Vene16, Lebervene17oder die Milz-18. Derzeit Lebervene Infusion und intrasplenic Transplantation von Leberzellen das bevorzugte Verfahren, da sie leichter zu reproduzieren.
In diesem Papier haben wir ein Verfahren für eine 30 % teilweise Hepatektomie in NOD beschrieben. SCID (NICKEN. CB17-Prkdcscid/J) Mäuse, in denen die linken Leberlappen herausgeschnitten. Es folgt durch Transplantation von 0,2 Millionen GFP mit dem Ausdruck ihrer Maus (C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J) Hepatozyten sowie menschlichen Ursprungs NeoHep19 in der Milz. Dieses Verfahren führt zu Engraftment der transplantierten Zellen in der Leber. Dieses Verfahren ist die wenigsten invasive und minimal schmerzhaft Technik.
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Protocol
Verfahren vorgestellt, die in diesem Protokoll wurden von der institutionellen Tier-Ethik-Kommission des nationalen Institut für Immunologie, Neu-Delhi genehmigt. Die serielle Nummer der Genehmigung ist OIEA #319/13.
Hinweis: Es gibt exzellente Ressourcen auf allgemeine Chirurgie Verfahren20 und spezifische Protokolle für Nager Chirurgie21. Für diejenigen, die tierischen Operation zum ersten Mal empfiehlt es sich ausgiebig üben chirurgische Eingriffe auf Attrappen vor Inbetriebnahme auf Tiere.
1. Vorbereitung
- Halten Sie vor dem Experiment sterile Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) "oder" saline bereit.
- Montieren Sie eine Chirurgie-Kit mit Schere, gezahnte Pinzette Gewebe Zange, Baumwolle, Wattestäbchen, Nylonfäden und verschiedenen Mikro Nadelhalter. Autoklaven der Chirurgie-Kit. Besondere Sorgfalt sollte wenn ein immungeschwächter NICKEN. SCID-Maus wird in das Protokoll aufgenommen.
- Führen Sie das komplette experimentelle Verfahren, von der Vorbereitung bis zum Ende der Operation, in der Bio-Sicherheit Klasse I Schrank.
- Wiegen Sie ein NICKEN. SCID-Maus von ca. 6-8 Wochen vor der Operation. Mäuse mit einem Gewicht zwischen 14-18 g sind in dieser Studie verwendet.
- Rasur der oberen Mittel- und Hypochonder Bauchregion der Maus mit dem Haarschneidegerät. Gelten Sie Haare entfernen Creme gleichmäßig in der gesamten Region mit einem Spatel die abgeschnittenen Haare vollständig zu entfernen. Entfernen Sie die Haare vorsichtig mit Hilfe eines sterilen feuchten Baumwolltuch nach 2-5 Minuten.
- Platzieren Sie den Mauszeiger in der Kammer Isoflurane und schalte das Ventil der Sauerstoffflasche. Pflegen Sie die Sauerstoffzufuhr zum Preis von 4 L/min und Isofluran Verdampfung bei 4 %, Anästhesie zu induzieren.
- Stellen Sie sicher, dass die Maus richtig durch sanfte Zeh kneifen betäubt worden ist.
- Legen Sie eine Operation Board innerhalb eines Biosafety Kabinett. Legen Sie das Tier auf dem Chirurgie-Brett, so dass der ventrale Teil der Maus nach oben zeigt und der vordere Teil der Maus sich im Inneren der Nase Kegel Isoflurane und Sauerstoff angeschlossen befindet.
- Isofluran Verdampfung auf 2 % zu reduzieren, und während des chirurgischen Verfahrens zu erhalten.
- Desinfizieren Sie die Haut von der Maus und durch Abwischen mit 70 % igem Ethanol getränkten sterilen Baumwolle zu sterilisieren.
2. chirurgische Verfahren
-
Partielle Hepatektomie
- Quereinschnitt von etwa 1 cm in der Haut direkt unter dem Brustbein, senkrecht an den Xiphoid Prozeß und Parallel zu den Brustkorb mit Hilfe der geraden OP Schere vornehmen.
- Trennen Sie vorsichtig die Haut mit der Bauchmuskel-Schicht in der Nähe der eingeritzten mit Pinzette oder sterilen angefeuchteten Wattestäbchen zu unterscheiden zwischen Haut und Bauchmuskulatur Schicht angebracht. Genießen Sie die intradermale Region mit PBS mit sterilen Wattestäbchen um Austrocknung zu entgehen.
- Setzen Sie Bereich der linke Lappen glatt durch eine quer Schnitt durch die Peritonealdialyse Schicht direkt unter dem Xiphoid aus. Verwenden Sie zwei angefeuchteten Wattestäbchen zu entlarven und heben Sie den linken Leberlappen.
- Platzieren Sie ein Wattestäbchen auf der Bauch-Seite des Schnitts, und legen Sie ein weiteres Wattetupfer auf die Membranseite. Vorsichtig drücken Sie die Spitze in Richtung der Membran platziert und geben Sie einen gleitenden Push durch die andere Spitze, heben Sie den linken Leberlappen.
- Stecke einen Nylonfaden mit einer Schleife durch die angehobene linke Lappen und schieben Sie die Schlaufe in Richtung zur Unterseite des linken Lappens in der Nähe der Hilum mit Hilfe der Mikro-Pinzetten oder Baumwolle-Tipps. Drücken Sie die Fadenschlinge Nylon vorsichtig an der Basis des linken Lappens.
- Binden Sie die beiden Enden der Nylonfaden über den oberen Teil der linken Lappen mit einem Mikrochirurgie Nadelhalter und Mikro Zange. Machen Sie zwei zusätzliche Knoten auf der anderen Seite.
- Der gebundene Lappen mit Hilfe der Schere zu sezieren. Versuchen Sie nicht, sehr nah an das Gewinde schneiden. Für den Fall, dass der Vorgang länger als 5 Minuten dauert, halten Sie die Bauchhöhle und die Organe feucht mit sterilen PBS, Austrocknung durch Flüssigkeitsverlust zu vermeiden.
- Nähen Sie das Peritoneum kontinuierliche näht mit einer 4: 0 Catgut Naht. Schließen Sie anschließend die Haut durch diskontinuierliche vernähen so schnell wie möglich.
-
Stammzelltransplantation
Hinweis: Die GLP mit dem Ausdruck ihrer Hepatozyten wurden isoliert von transgenen Mäusen GFP (C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30 Scha/J), nach dem Verfahren von Lee Et al.beschrieben. 22 und Shen Et Al. 23 Hepatozyten-ähnliche Zellen (NeoHep) der menschlichen Ursprungs unterschieden von Monozyten24 dienten auch zur Transplantation. Jedoch können auch Zellen aus anderen Quellen im Protokoll verwendet werden.- 0,2 Millionen lebensfähige Zellen in rund 50 µL der Iscoves geändert Dulbecco Medium (IMDM) auszusetzen, und in einer 1 mL Insulin Spritze begrenzt mit 30 G Nadel Aspirieren. Halten Sie die Spritze kalt, indem es auf Eis.
- Platzieren Sie den Mauszeiger in einer Weise, die der linken seitliche Teil in Richtung der Person, die die Operation nach oben zeigt. Identifizieren der Milz Gegend und quer sezieren die Haut in der Nähe der Hypochonder Region, gefolgt von einen kurzen Schnitt durch die Peritonealdialyse Schicht nur um die Milz zu entlarven.
- Heben Sie die Milz und halten Sie es außerhalb der Hohlraum mit Hilfe von zwei PBS Wattestäbchen angefeuchtet.
- Festhalten Sie die Milz mit zwei Wattestäbchen vorsichtig mit einer Hand, und legen Sie die Nadel der Spritze genau senkrecht zur Milz. Sanft die Milz durchbohren und schieben Sie die Nadel sehr langsam innen; die Nadel sollte nicht tiefer als 2 mm erhalten.
- Drücken Sie den Kolben der Spritze langsam um die Zellen in der Milz zu injizieren. Nach der Transplantation die Nadel der Spritze stabil zu halten und langsam von der Milz, Blutung zu vermeiden oder Verlust von Zellen zu entfernen.
- Nach dem Platzieren der Milz wieder in die Bauchhöhle mit dem Wattestäbchen, schließen Sie die Peritonealdialyse Schicht durch kontinuierliche Vernähen mit einem 4: 0 Catgut Naht. Nähen Sie die Haut diskontinuierlich mit der selben Naht. Vermeiden Sie die Verwendung von Wunde Clips zum Verschließen der Haut; Stattdessen schließen sie durch einen 4: 0-Naht. Die Wunde Clips schränken die natürliche Bewegung der Maus, und oft Clips locker und schnell herauskommen.
3. postoperative Pflege
- Wischen Sie nach dem Schließen der Haut, die Umgebung der beiden Naht Standorte mit Jod-Lösung (Betadine) mit einem sterilen Wattetupfer.
- Eine Dosis von Antibiotika Cefotaxim zu injizieren, da 600 mg/kg (in der Regel 12 mg Cefotaxim in 100 µL der Saline/Maus) intraperitoneal des Körpergewichts mit 1 mL Spritze.
- Geben Sie tägliche Dosen von Schmerzmittel Meloxicam als 1 mg/kg Körpergewicht (in der Regel 12 µg Meloxicam in 100 µL der Saline/Maus), um das Tier intraperitoneal, für bis zu drei Tage nach der Operation.
- Stoppen Sie nach Beendigung der Operation wird der Gasstrom Isofluran zu und platzieren Sie den Mauszeiger wieder zurück in die individuell belüfteten Käfig.
4. Euthanization und Charakterisierungen
- Nach der experimentellen Endpunkte (1 Tag und 10 Tage nach der Operation) einschläfern Sie die Mäuse nach den institutionellen Tierethik-Richtlinien.
- Sammeln Sie Blut durch die Tiere, Punktion der okulären terminal Plexus unheilbar Blutungen.
- Serum aus dem Blut zu isolieren.
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Representative Results
Hepatozyten Verbreitung nach 30 % teilweise Hepatektomie: Die Verbreitung von Hepatozyten in den verbleibenden nach 30 % Hepatektomie Leber wurde durch immunhistochemische (IHC) Färbung für eine Verbreitung Zellmarkierung, Ki-67 geprüft. Tages-Post Hepatektomie, die Mäuse wurden eingeschläfert, die verbleibenden Leber Lappen wurden herausgeschnitten und Paraffin Abschnitte wurden erhalten. Die Abschnitte wurden mit Ki-67-Antikörper, gefolgt von Etikettierung mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) konjugierten Sekundärantikörper gebeizt. Di-Amino Benzidine (DAB) als Substrat für HRP für die Entwicklung von brauner Farbe diente um gefärbte Zellen zu identifizieren. Der Kern war gefärbt mit Hämatoxylin und Mikroskop 20 X Objektiv betrachtet. Abbildung 1 zeigt ein repräsentatives Bild der IHC Leber Teil. Rund 13 % der Zellen (13.66 ± 0.317, N = 3) Ki-67 waren positiv, was bestätigt, dass eine 30 %-Hepatektomie Verbreitung von Hepatozyten in der Leber Maus erleichtert.
Anatomische Studie: Ein repräsentatives Bild der Leber ein NICKEN. SCID-Maus, 10 Tage Post Hepatektomie in Abbildung 2dargestellt ist. Dieses Bild bestätigt, dass die verbleibenden Leber gesund mit keine sichtbaren Auffälligkeiten.
Vorhandensein von transplantierten Zellen während der ersten Stunde der Chirurgie: Die Referenzfahrt der transplantierten Zellen wurde mit durchflusszytometrischen Analyse bestätigt, durch die Untersuchung des Vorhandensein von GFP positive Hepatozyten 2 Stunden nach der Transplantation.
Ein einzelnes Zellsuspension wurde von der Milz und Leber von der Host-Maus nach enzymatische Verdauung des ausgeschnittenen Gewebes post 2 Stunden der GFP-Hepatozyten Transplantation erhalten. Der Anteil der transplantierten GFP-positiven Zellen wurde mit einem Durchflusszytometer geschätzt. Ein Scatter-Tor wurde aus dem entsprechenden FSC-SSC Dot-Plot zur Beseitigung der Trümmer und Wams Zellen ausgewählt. Der Quadrant-Tor der Handlung entstand durch Fluorochrom Hintergrundintensität Zellsuspensionen gewonnen aus der Milz und Leber Mausklick Kontrolle, in denen keine Zellen transplantiert wurden. Rund 1,7 % positive Hepatozyten GFP fanden sich in der Milz, und keine GFP Hepatozyten wurden 2 Stunden nach der Transplantation in der Leber gefunden. Repräsentative Daten sind in Abbildung 3dargestellt.
Immunohistochemistry: Zehn Tage nach der Operation, die Mäuse wurden eingeschläfert, und der rechten seitlichen Lappen, der rechts mediale Lappen und die linken medialen Lappen der Leber wurden herausgeschnitten und Cryo-Schnitt wurde durchgeführt, um 5 µm Abschnitte zu erhalten. Diese Abschnitte wurden dann für die Referenzfahrt und Engraftment der transplantierten Zellen untersucht. Abbildung 4 zeigt die repräsentative Bilder der immunhistochemische (IHC) Färbung gegen Anti-GLP (rot) zu identifizieren, die GFP mit dem Ausdruck Mäuse Hepatozyten (Gruppe A, Bund C); und gegen Anti-Human-Albumin (rot), als auch Anti-Human Connexin 32 (grün), Hepatozyten-ähnliche Zellen (NeoHep) der menschlichen Ursprungs zu identifizieren (panel D, E, Fund G). Der Kern war mit 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI, blau) in beiden Fällen counterstained. In dieser Bild-Tafeln ein paar eingepflanzt GFP mit dem Ausdruck Hepatozyten (Gruppe A, Bund C) und NeoHep ( D, E, Fund G) sind deutlich sichtbar.
Biochemische Analyse der Leber sezerniert Enzyme: Um die Funktionalität der Leber nach dem chirurgischen Eingriff zu überprüfen, wurde biochemische Analyse der verschiedenen sekretierten Leberenzyme durchgeführt. Die Balkendiagramme in Abbildung 5 repräsentieren den Mittelwert der Aspartat-Aminotransferase (AST), Alanin-Aminotransferase (ALT) und alkalische Phosphatase (ALK-PHOS) im Serum von gesunden NICKEN. SCID Mäuse, und verschiedene Gruppen von teilweise Hepatectomized Mäuse. Es ergibt sich aus dem Diagramm, dass nach 1 Tag Hepatektomie, Ebenen von AST, ALT und ALK PHOS Enzymen stark angestiegen, im Vergleich zu den gesunden Mäusen.
Die ALT und AST Enzym Ebenen waren normal, restauriert, während ALK PHOS Ebenen blieb hoch zehn Tage Chirurgie nicht transplantierten Mäusen post. Jedoch sank das Niveau aller drei Enzyme zur Normalität im transplantierten Mäusen nach 10 Tagen.
Leber histologische Studie: Die Leber Proben der Hepatectomized und transplantierten Mäusen wurden für die histologische Analyse der anatomischen Veränderungen nach der Operation zu studieren weiterverarbeitet. Abbildung 6 zeigt die repräsentative Hellfeld, Bilder von Hämatoxylin und Eosin (H und E) gebeizt Leber Abschnitte von gesunden Mäusen ohne Operation, 1 Tag buchen teilweisen Hepatektomie und 10 Tage teilweise Hepatektomie und NeoHep Transplantation. In diesen Bildern Leberschäden durch die milde Peri-biliären Fibrose oder Bindegewebe Verbreitung wurde nach 1 Tag der partiellen Hepatektomie beobachtet, und keine Auffälligkeiten beobachtet wurden zehn Tage nach der Operation.
Abbildung 1 : Ein repräsentatives Bild der Ki-67 Färbung von NOD. SCID Leber Teil nach 1 Tag 30 % Hepatektomie. Abschnitt wurde mit Ki-67 Antikörper gefärbt, Meerrettich-Peroxidase (HRP) konjugierten Sekundärantikörper, DAB (braun) diente als HRP Substrat und Kerne wurden von Hämatoxylin (blau) counterstained. Die indikativen Pfeilspitzen zeigen sich einige der Ki-67 positiven (braunen) Zellen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Regeneriert Leber Lappen ein NICKEN. SCID Maus 10 Tage nach der Operation. A: caudatus Lappen (caudatus-Prozess), B: rechten seitlichen Lappen, C: rechts mediale Lappen, D: Links medialen Lappen, E: Herz, F: verbleibenden linken seitlichen Lappen nach Hepatektomie und G: caudatus Lappen (papilläre Prozess). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Prozentsatz der GFP positive Maus Heptatocytes in der Milz und Leber ein NICKEN. SCID Maus. Die oberen Platten zeigen die Zelle Profil einer Alter abgestimmte Steuerung Maus, in denen keine Zellen transplantiert wurden. Untere Platten zeigen die Zelle Profil nach 2 Stunden der GFP Hepatozyten Transplantation in einer Hepatectomized Maus. Die y-Achse der Grundstücke bezeichnet der Fluoreszenzintensität der GLP (FITC Kanal) in beliebigen Einheiten auf einer logarithmischen Skala gemessen, und die x-Achse bezeichnet den forward Scatter (FSC) in beliebigen Einheiten auf einer linearen Skala. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Der Homing der transplantierten GLP Maus Hepatozyten und NeoHep in der Leber regenerierte Host auszudrücken. Repräsentative Bilder der Leber Abschnitte von einer teilweise Hepatectomized NOD. SCID Maus transplantiert mit GFP positive Maus Hepatozyten (A-C), zeigt die Zelle Engraftment und homing. Gruppe A: Kern (blau: DAPI), Panel B: Anti-GLP (rot: Alexa Fluor 594), Panel C: zusammengeführten Bild. Platten (D-G) Messebereich Leber von teilweise Hepatectomized NOD. SCID-Maus in die NeoHep transplantiert wurden. Panel D: Kern (blau: DAPI), Panel E: menschlichen Anti-Connexin 32 (grün: Alexa Fluor 488), Anti-Humanalbumin Panel F: (rot: Alexa Fluor 594) und Panel G: zusammengeführten Bild. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 : Biochemische Analyse der verschiedenen Leber abgesondert Enzyme in Mäusen Serum. Spalte Balken repräsentieren die Mittelwerte von verschiedenen Enzymen (AST/SGOT, ALT/SGPT, ALK PHOS). Der Zeitpunkt der Untersuchung nach der Operation wird auf der x-Achse angezeigt. In der Kontrollgruppe gab es Alter abgestimmt NICKEN. SCID-Mäuse und keine Operation durchgeführt wurde. Fehlerbalken kennzeichnen den Standardfehler des Mittelwerts, N = 3 und * zeigt p< 0,05, NS zeigt nicht-Bedeutung bei p> 0.05. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6 : Histopathologische Untersuchung von Mäusen Leber Gewebeschnitte. Repräsentative Hellfeld Mikroskopieren Bilder von Hämatoxylin und Eosin (H und E) gebeizt Lebergewebe Abschnitte von NOD. SCID-Mäusen unter 20 X Objektiv. Zentrale A zeigt einen Leber Ausschnitt aus einem gesunden NICKEN. SCID-Maus im gleichen Alter ohne Operation. Zentrale B zeigt eine Leber Abschnitt 1 Tag post teilweise Hepatektomie. In diesem Bild zeigen Pfeilspitzen die milden Peri-Billiary Fibrose oder Bindegewebe-Verbreitung-Region. C zeigt eine Leber Abschnitt zehn Tage Post teilweise Hepatektomie und Cell Transplantation. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Partielle Hepatektomie ist eine etablierte Methode zur Untersuchung Leberregeneration und übermäßige Hepatektomie wird berichtet, dass der AHF-Modell zu imitieren. Tiermodelle der AHF gehören Nagetiere, insbesondere Mäuse, das am besten untersuchte Modell. Um eine Schädigung der Leber-Modell bei Mäusen bis zu einer 70 % Hepatektomie zu erhalten wurde mit einer guten überleben Rate25,26gemeldet. Aber nackt und andere immungeschwächte Maus, eine 70 % Hepatektomie wurde berichtet, wie fatal und Tiere starben innerhalb von 24 Stunden27.
Mitchell und Willenbring28 demonstriert eine reproduzierbare und gut verträgliche Methode für 2/3 teilweise Hepatektomie bei Mäusen. Für NICKEN. SCID Mäuse erhielten wir eine Überlebensrate von 100 % als die Hepatektomie eingeschränkt bis die Resektion des linken Leber Lappens, die fast 30 % der gesamten Leber Masse ist. Im Einklang mit den Beobachtungen auf nackten Mäusen27beobachteten wir, dass jede weitere der Prozentsatz der Hepatektomie in NOD Erhöhung. SCID-Maus führt zu einer dramatischen Senkung der Überlebensrate. Darüber hinaus bestätigt Verbreitung von Hepatozyten in den verbleibenden Leber Lappen Post 1 Tag von 30 % teilweise Hepatektomie das Dienstprogramm dieses Verfahrens in Transplantation und Engraftment Studien.
In einer neueren Arbeit, Ahmed S.U. Et al. 29 haben gezeigt, dass ein Verfahren zur intrahepatischen hepatozellulären Karzinom Xenotransplantate immungeschwächte Mäuse. Sie haben ein Verfahren zur Transplantation von Tumorzellen in verschiedenen Organen, einschließlich der Milz und durchgeführt Hepatektomie Erleichterung intrahepatischen Engraftment gezeigt.
In den Verfahren von Mitchell28 und Ahmed29berichtet gibt es eine Chance für Verbesserungen durch eine viel kleinere Inzisionen, wie kleinere Inzisionen in der Chirurgie im Allgemeinen bevorzugt werden. Es gibt Beweise30 , die ein kleinerer Länge chirurgischen Schnitt zu weniger Stresshormone wie Cortisol und Katecholamin-Sekretion führt. Darüber hinaus fanden wir, dass Verfahren im Zusammenhang mit einem größeren Schnitt ein höheres Maß an Fähigkeiten erfordern und sind schwieriger zu reproduzieren, im Vergleich zu Verfahren mit zwei kleinere Hautschnitte.
In diesem Papier haben wir beschrieben, ein Verfahren, in denen minimale Inzision erforderlich ist, um den linken Leberlappen aussetzen, und nach der Durchführung einer 30 %-Hepatektomie, ein weiterer kleiner Schnitt wurde vorgenommen, um die Milz aussetzen, wo Zellen implantiert wurden. Dieses Verfahren erfordert keine speziellen chirurgische Fähigkeiten und kann in ca. 5-7 min abgeschlossen werden. Darüber hinaus fanden wir keine Hinweise auf irgendwelche morphologischen oder anatomische Anomalie in der übrigen Leber Masse, wie histologische Studien belegt. Darüber hinaus gab es eine Abwesenheit von Ischämie oder Nekrose während des chirurgischen Eingriffs der 6-8 Woche-alten Immunsystem beeinträchtigt Mäuse. Die Induktion einer Leberschädigung nach teilweiser Hepatektomie wird durch die erhöhte Leberenzyme AST, ALT und ALK-PHOSin Mäusen Serum bestätigt. Eine intrasplenic Route wurde für Zelltransplantation gegenüber anderen venösen Routen gewählt, weil das Portal venöse System höhere Erreichbarkeit in die Leber Rinde als andere venösen Systeme. Wir haben bewiesen, dass die Transplantation von Leberzellen isoliert von einer transgenen GFP-Maus und NeoHep die sind differenzierter Hepatozyten-ähnliche Zellen menschlichen Ursprungs, in teilweise Hepatectomized NOD. SCID Tiere. Das Verfahren beschränkt nicht die Art von Zellen für die Transplantation verwendet.
Dieses Verfahren schafft nicht den AHF-Zustand in eine Maus, jedoch nur eine 30 % teilweise Hepatektomie durchgeführt wird. Diese begrenzte Hepatektomie bietet eine proliferative Potential, Hepatozyten in der übrigen Leber, vorsieht, dadurch zusätzliche Möglichkeiten für transplantierte Hepatozyten Engraftment vorhanden. Es zeigt nur die Migration und Engraftment Hepatozyten und NeoHep aus der Milz, die Leber, und keine weiteren Schäden an der Leber erfolgt durch die Transplantationsverfahren.
Alles in allem dieses Verfahren ist einfach, praktiziert und leicht gemeistert, um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. Das regenerative Potential von mehreren zelluläre Quellen (Stammzellen oder Hepatozyten-ähnliche Zellen) im Zusammenhang mit der Schädigung der Leber oder der Leberregeneration Studie kann leicht mit diesem chirurgischen Verfahren ausgewertet werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch den Kern Grant erhielt von der Abteilung Biotechnologie, Regierung von Indien, dem nationalen Institut für Immunologie, Neu-Delhi unterstützt. Dr. Bhattacharjee aktuelle Adresse ist die Abteilung für Gastroenterologie, Hepatologie und Ernährung, Kinder Hospital Los Angeles.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gas Anesthesia System | Ugo Basile; Italy | 211000 | |
| Weighing machine | Goldtech ; India | Local Procurement | |
| Biological safety cabinet ( Class I) | Kartos international; India | Local Procurement | |
| Hair Trimmer | Panasonic ; Japan | ER-GY10 | |
| Straight operating scissor with sharp /sharp blades | Major Surgicals; India | Local Procurement | |
| Forceps with Serrations | Major Surgicals; India | Local Procurement | |
| Micro needle holders straight & curved | Mercian ; England | BS-13-8 | |
| 1 ml insulin syringe with 30G *5/16 needles | Dispo Van; India | ||
| 1 ml syringe with 26 G * 1/2 needle | BD ; US | REF 303060 | |
| Nylon Threads | Mighty ; India | (1-0) Local Procurement | |
| MERSUTURES 4-0 Sterilised Surgical Needled Suture | Ethicon, Johnson & Johnson, India | NW 5047 | |
| TRUGUT 76 cm 4-0 absorbable surgical suture | Sutures India Pvt. Ltd; India | SN 5048 | Sterilised Surgical Needled Suture Catgut Chromic |
| Cotton Buds | Pure Swabs Pvt Ltd ; India | Local Procurement | |
| Surgical Tape | 3M India ; India | 1530-1 | Micropore Surgical Tape |
| Microtome | Histo-Line Laboratories, Italy | MRS3500 | |
| Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation ; US | ||
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss ; Germany | LSM 510 META | |
| Bright Field Microscope | Olympus, Japan | LX51 | |
| Automated analyser | Tulip, Alto Santracruz, India | Screen Maaster 3000 | Biochemical analyser for liver functional test |
| Flow Cytometer | BD ; US | BD FACSverse | Assesment of presence of cells post transplantation |
| Veet hair removal cream | Reckitt Benckiser , India | ||
| FORANE | Abbott ; US | isoflurane USP 99.9% | |
| Taxim | AlKem ; India | cefotaxime sodium injection | |
| Povidone-Iodine solution | Win-Medicare; India | Betadine | |
| Paraformaldehyde | Himedia; India | GRM 3660 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Life technologies, Thermo Fisher scientific ; US | 12200-036 | |
| Sucrose | Sigma ; US | S0389 | |
| Tissue-Tek | Sakura; US | 25608-930 | O.C.T compound |
| DAPI | Himedia; India | MB 097 | |
| anti-Albumin goat Polyclonal | Thermo Scientific,Pierce, US | PA126081 | |
| anti-connexin 32/GJB1 Polyclonal | abcam, UK | ab64609-500 | |
| antiGFP rabbit polyclonal | Santa Cruz biotechnology; US | SC 8334 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-goat | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A11058 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A11015 | |
| Alexa Fluor 594 chicken anti rabbit | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A21442 | |
| Goat anti rabbit IgG HRP | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific; US | 65-6120 | |
| anti-Ki67 antibody | abcam, UK | ab15580 | |
| Antigen Unmasking Solution, Citric acid base | Vector laboratories, US | H-3300 | |
| ProLong Diamond antifade mountant | Life technologies, Thermo Fisher scientific ; US | P36966 | |
| SGOT (ASAT) KIT | Coral Clinical System, India | ||
| SGPT (ALAT) KIT | Coral Clinical System, India | ||
| Alkaline Phosphatase Kit (DEA) | Coral Clinical System, India | ||
| Hematoxylin Solution, Mayer's | Sigma ; US | MHS16 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma ; US | HT110132 | |
| DPX Mountant | Sigma ; US | 6522 | |
| Melonex (Pain Killer) | Intas Pharmaceuticals Ltd; India | Meloxicam injection | |
| DAB enhanced liquid substrate system tetrahydrochloride | Sigma ; US | D3939 |
References
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