عزل وثقافة الكرياتينية الماوس الرئيسية من حديثي الولادة والفأر الكبار الجلد
Summary
تشكل الخلايا الكيراتينية البشرة حاجز الجلد وظيفية ويتم وضعها في الخط الأمامي للدفاع المضيف ضد الشتائم البيئية الخارجية. هنا نحن تصف أساليب العزلة والثقافة الأولية من الخلايا الكيراتينية البشرة من حديثي الولادة والجلد الماوس الكبار، وتحريض من التمايز الطرفية والاستجابة الالتهابية أوفب أثارت من الخلايا الكيراتينية.
Abstract
الكيراتين (كك) هو نوع الخلية السائدة في البشرة، الطبقة الخارجية من الجلد. البشرة تلعب كك دورا حاسما في توفير دفاع الجلد عن طريق تشكيل حاجز الجلد سليمة ضد الإهانات البيئية، مثل الأشعة فوق البنفسجية التشعيع أو مسببات الأمراض، وأيضا عن طريق الشروع في استجابة التهابية على تلك الشتائم. هنا نحن تصف طرق لعزل ككس من جلد الماوس حديثي الولادة ومن الكبار الجلد ذيل الماوس. نحن أيضا وصف ظروف زراعة باستخدام مكملات النمو المحددة (دغس) بالمقارنة مع مصل الدم البقري الجنيني (كفبس). وظيفيا، وتبين لنا أن كل من كونات حديثي الولادة والكبار تستجيب للغاية إلى ارتفاع التوليف محطة الناجم عن الكالسيوم، وتشكيل تقاطع ضيق وطبقية. بالإضافة إلى ذلك، ككس الكبار مثقف عرضة للإصابة بالخلايا التي تسببها أوفب ويمكن أن يطلق كميات كبيرة من تنف على الأشعة فوق البنفسجية الأشعة فوق البنفسجية. معا، فإن الطرق الموصوفة هنا تكون مفيدة للباحثين عن إعداد نموذج في المختبرق لدراسة البيولوجيا البشرة في الماوس حديثي الولادة و / أو الماوس الكبار.
Introduction
الجلد هو أكبر جهاز في الجسم مع البشرة كما الخارجي معظم طبقة. البشرة تلعب دورا حاسما في تشكيل حاجز البشرة سليمة لفصل الجسم من البيئة، وبالتالي يمنع فقدان المياه ويوفر الحماية من الإهانات البيئية، مثل مسببات الحساسية، مسببات الأمراض والتعرض أوفب. البشرة تتطور من طبقة واحدة من الخلايا الكيراتينية القاعدية غير المتمايزة (ككس) في ظهارة طبقية متعددة الطبقات تتكون من طبقة القاعدية، تليها طبقة سبينوس، طبقة الحبيبية، وطبقة القرنية. بسال ككس، تتكون من كل من الخلايا الجذعية للبشرة وخلايا تضخيم العبور، هي التكاثري وغير متمايزة. كما كك القاعدية الخروج من دورة الخلية، وتلتزم الخلايا إلى التمايز وتهاجر تدريجيا نحو سطح البشرة، يرافقه نضوج تقاطعات الخلايا الخلوية وتشكيل حاجز نفاذية البشرة (إب). و ككس في الطبقة الشائكة التعبير عن الاختلافات في وقت مبكرعلامات أيون مثل الكيراتين 10 (K10). كما تهاجر ككس إلى الطبقة الحبيبية، والخلايا تعبر عن علامات التمايز المتأخر مثل فيلاغرين (فلغ)، لوريكرين (لور) و إنفولوكرين (إنف). في الطبقة القرنية، و كك تصبح متباينة كورنيوسيتس متباينة، والتي تسقط في نهاية المطاف من خلال التقشر كما خلايا جديدة محلها.
ويعتبر الكالسيوم العامل الأكثر فسيولوجية في البشرة ويؤدي التمايز في المختبر وفي الجسم الحي بطريقة مماثلة. في البشرة العادية البشرة، أيونات الكالسيوم تشكل مميزة "تركيز التدرج"، وزيادة في التركيز نحو سطح الجلد 1 ، 2 ، 3 . ويرتفع تركيز الكالسيوم من المستويات المنخفضة في الطبقات الفرعية الدنيا (الطبقات القاعدية والسبينوس) إلى ذروة الطبقة الحبيبية العليا ثم ينخفض إلى مستويات لا تذكر في الطبقة السطحية الأكثر (الطبقة القرنية). يتطور التدرج الكالسيوم أيضا من قبيل الصدفة مع ظهور حاجز نفاذية المكون، والذي يدعم أن إشارات الكالسيوم تلعب دورا حاسما في التمايز كك. في المختبر ، والكالسيوم منخفض (0.02-0.1 ملم) يحافظ على انتشار كك القاعدية كما أحادي الطبقة، في حين أن ارتفاع الكالسيوم (> 0.1 ملم) يدفع التزام سريع ولا رجعة فيه من الخلايا إلى التمايز الطرفية كما يتضح من تشكيل تقاطع ضيق والتحريض من لور و إنف على ارتفاع الكالسيوم العلاج إلى ككس القاعدية 4 ، 5 .
بالإضافة إلى تشكيل حاجز، كك البشرة هي أيضا عنصرا هاما من نظام المناعة الفطرية في الجلد. استجابة لمسببات الأمراض أو أنماط الجزيئية المرتبطة التالفة (دامبس) صدر على أشعة أوفب أو إصابة، ككس يمكن أن تنتج كميات كبيرة من السيتوكينات الالتهابية، مثل TNFα، IL6 و IFNβ، مما يؤدي إلى تنشيط جهاز المناعة> 6 ، 7 ، 8 ، 9 . على الرغم من أن الإشارات الالتهابية المناسبة من ككس مطلوبة للتخلص من الممرض، والاستجابة الالتهابية غير المنضبط قد تؤدي إلى تطوير الأمراض الجلدية للالتهابات، مثل الصدفية والوردية 6 ، 8 .
عموما، كك تلعب دورا حيويا في الحفاظ على حاجز الجلد سليمة والشروع في استجابة مناعية على غزو الممرض أو الإهانات البيئية. ولذلك، والثقافة الأولية من كك البشرة هي تقنية مفيدة لدراسة البيولوجيا الظهارية، والتمايز كك، فضلا عن استجابات المناعة الفطرية تحفيز كك. العزلة والثقافة الأولية كوز البشرة الماوس يمكن أن يكون عملية صعبة بسبب حساسية كك وحساسية لمختلف المنبهات الخارجية. هنا نحن تصف طريقة لعزل والثقافة ككس إما من جلد الماوس حديثي الولادة أوبالغ، ذيل الفأر، جلد. للكبار كك العزلة، ونحن لا تستخدم الجلد الظهري الماوس لعزل كميات كافية من كك قابلة للحياة من هذا النسيج يمكن أن يكون صعبا للأسباب التالية: أولا، الجلد الظهرية الكبار في مرحلة يستريح من دورة الشعر (تيلوجين) يتكون من رقيقة البشرة مع 1-2 طبقات فقط من الخلايا، مما يؤدي إلى انخفاض العائد الخلية وفصل غير فعال للبشرة من الأدمة، والتي هي الخطوة الحاسمة لنجاح عزل كك. ثانيا، ارتفاع كثافة بصيلات الشعر الذي هو موجود على الجلد الظهرية الكبار يزيد من صعوبة في فصل البشرة من الأدمة. بدلا من ذلك، نحن بشكل روتيني استخدام الجلد الذيل كمصدر للكبار الماوس الماوس كك هذه الظهارة هي أكثر سمكا مع 3-5 طبقات من كك البشرة. كما أن لديها أقل كثافة بصيلات الشعر، والتي لا تتداخل مع الانفصال البشرة، مما يسمح عزل كك من أي الكبار الجلد ذيل الماوس بغض النظر عن العمر ومرحلة ركوب الدراجات الشعر من الماوس. نينا معزولةتصنف ككس تال للأطباق ثقافة الجيلاتين المغلفة، في حين يتم استخدام الأطباق المغلفة الكولاجين للبذور معزولة ككس الكبار بسبب ضعف القدرة من الخلايا الكبار على الانضمام إلى نظرائهم حديثي الولادة. لثقافة الماوس ككس، ويستكمل منخفض الكالسيوم المتوسطة القاعدية مع دغس، الذي يحتوي على عامل نمو البشرة (إغف)، ترانسفيرين البقري، مثل الأنسولين النمو IGUC1 (IGF1)، البروستاجلاندين E2 (PGE2)، ألبومين المصل البقري (بسا) والهيدروكورتيزون. بين 2-4 أيام بعد الطلاء الأولي، يمكن أن تغسل معظم ككس متباينة خلال التغييرات المتوسطة اليومية، وتبين الخلايا الملتصقة المتبقية التشكل المرصوف بالحصى النموذجي 4 ، تتكاثر، ولا تعبر عن التمايز المبكر علامة K10.
Protocol
Representative Results
Discussion
البشرة البشرة وظائف كحاجز حاسم لفصل وحماية الجسم من البيئة الخارجية والضرر من فقدان المياه، مسببات الأمراض، الحرارة والأشعة فوق البنفسجية التشعيع. و ككس هي سلالة الخلايا السائدة من البشرة، والثقافة الأساسية لل كك البشرة هي أداة مفيدة لدراسة وفهم العمليات البيولوج?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني لأمراض المفاصل والأمراض العظمية والسكري والجسم منح (R01AR069653 لتشانغ لج)، والمعاهد الوطنية للدعم الصحي (5T32AR062496-03 إلى كا).
Materials
| C57BL/6 neonates or adult wildtype mice | Jackson Laboratory | 000664 | Wildtype mice (originally purchased from Jackson Laboratory) are breeded and maintained in animal vivarium at UCSD. |
| KC basal medium (EpiLife) | Invitrogen, Carlsbad, CA | MEPICF500 | basal medium for keratinocyte culture with 0.06 mM CaCl2 |
| Defined Growth Supplement (dGS) | Invitrogen, Carlsbad, CA | S0125 | defined growth supplements for culture medium |
| Dispase powder | Invitrogen, Carlsbad, CA | 17105041 | enzyme to dissociate the epidermis from dermis |
| Attachment Factor | Invitrogen, Carlsbad, CA | S006100 | gelatin-based coating material |
| Coating Matrix | Invitrogen, Carlsbad, CA | R011K | Collagen-based coating material |
| TrypLE | Invitrogen, Carlsbad, CA | 12604-013 | A gentle trypsin-like enzyme to dissociate keratinocytes from epidermal sheet |
| 100 μm Cell Strainer Nylon mesh | Corning | 352360 | |
| CCK-8 cell viability Kit | Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD | CK04-11 | |
| Mouse TNF (Mono/Mono) ELISA Set II | BD Biosciences, San Jose, CA | 555268 | |
| Corded Hand-Held UV Lamps | Spectronics, Westbury, NY | EB-280C | |
| 8-watt UV tubes | Spectronics, Westbury, NY | BLE-8T312 | |
| Light Inverted Microscope for cell culture | ZEISS, Jena, Germany | Axio Observer | |
| Fluorescent Microscope | Olympus | BX41 |
References
- Mauro, T., et al. Acute barrier perturbation abolishes the Ca2+ and K+ gradients in murine epidermis: quantitative measurement using PIXE. J Invest Dermatol. 111 (6), 1198-1201 (1998).
- Menon, G. K., Grayson, S., Elias, P. M. Ionic calcium reservoirs in mammalian epidermis: ultrastructural localization by ion-capture cytochemistry. J Invest Dermatol. 84 (6), 508-512 (1985).
- Elias, P. M., et al. Formation of the epidermal calcium gradient coincides with key milestones of barrier ontogenesis in the rodent. J Invest Dermatol. 110 (4), 399-404 (1998).
- Hennings, H., et al. Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture. Cell. 19 (1), 245-254 (1980).
- Zhang, L. J., Bhattacharya, S., Leid, M., Ganguli-Indra, G., Indra, A. K. Ctip2 is a dynamic regulator of epidermal proliferation and differentiation by integrating EGFR and Notch signaling. J Cell Sci. 125 (Pt 23), 5733-5744 (2012).
- Lai, Y. P., et al. Commensal bacteria regulate Toll-like receptor 3-dependent inflammation after skin injury. Nat Med. 15 (12), 1377-1382 (2009).
- Bernard, J. J., et al. Ultraviolet radiation damages self noncoding RNA and is detected by TLR3. Nat Med. 18 (8), (2012).
- Zhang, L. J., et al. Antimicrobial Peptide LL37 and MAVS Signaling Drive Interferon-beta Production by Epidermal Keratinocytes during Skin Injury. Immunity. 45 (1), 119-130 (2016).
- Borkowski, A. W., et al. Toll-Like Receptor 3 Activation Is Required for Normal Skin Barrier Repair Following UV Damage. J Invest Dermatol. 135 (2), 569-578 (2015).
- Borkowski, A. W., et al. Toll-like receptor 3 activation is required for normal skin barrier repair following UV damage. J Invest Dermatol. 135 (2), 569-578 (2015).
- Zillessen, P., et al. Metabolic role of dipeptidyl peptidase 4 (DPP4) in primary human (pre)adipocytes. Sci Rep. 6, 23074 (2016).
- Wells, C. A., et al. The macrophage-inducible C-type lectin, mincle, is an essential component of the innate immune response to Candida albicans. J Immunol. 180 (11), 7404-7413 (2008).
- Vasioukhin, V., Bauer, C., Yin, M., Fuchs, E. Directed actin polymerization is the driving force for epithelial cell-cell adhesion. Cell. 100 (2), 209-219 (2000).
- Zhuang, L., et al. TNF receptor p55 plays a pivotal role in murine keratinocyte apoptosis induced by ultraviolet B irradiation. J Immunol. 162 (3), 1440-1447 (1999).
- Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nat Protoc. 3 (5), 799-810 (2008).
- Dlugosz, A. A., Glick, A. B., Tennenbaum, T., Weinberg, W. C., Yuspa, S. H. Isolation and utilization of epidermal keratinocytes for oncogene research. Methods Enzymol. 254, 3-20 (1995).
- Jones, J. C. Isolation and culture of mouse keratinocytes. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Pirrone, A., Hager, B., Fleckman, P. Primary mouse keratinocyte culture. Methods Mol Biol. 289, 3-14 (2005).
- Yuspa, S. H., Kilkenny, A. E., Steinert, P. M., Roop, D. R. Expression of murine epidermal differentiation markers is tightly regulated by restricted extracellular calcium concentrations in vitro. J Cell Biol. 109 (3), 1207-1217 (1989).
- Yuspa, S. H., et al. Signal transduction for proliferation and differentiation in keratinocytes. Ann N Y Acad Sci. 548, 191-196 (1988).
- Fang, N. X., et al. Calcium enhances mouse keratinocyte differentiation in vitro to differentially regulate expression of papillomavirus authentic and codon modified L1 genes. Virology. 365 (1), 187-197 (2007).
- Kolly, C., Suter, M. M., Muller, E. J. Proliferation, cell cycle exit, and onset of terminal differentiation in cultured keratinocytes: pre-programmed pathways in control of C-Myc and Notch1 prevail over extracellular calcium signals. J Invest Dermatol. 124 (5), 1014-1025 (2005).
- Marcelo, C. L., Gold, R. C., Fairley, J. A. Effect of 1.2 mmol/l calcium, triamcinolone acetonide, and retinoids on low-calcium regulated keratinocyte differentiation. Br J Dermatol. 111, 64-72 (1984).
