Изоляция и культура кератиноцитов первичной мыши от кожи новорожденных и взрослых мышей
Summary
Эпидермальные кератиноциты образуют функциональный кожный барьер и расположены на передней линии защиты хозяина от внешних экологических оскорблений. Здесь мы описываем методы выделения и первичной культуры эпидермальных кератиноцитов из кожи новорожденных и взрослых мышей, а также индукцию терминальной дифференцировки и вызванного УВБ воспалительного ответа от кератиноцитов.
Abstract
Кератиноцит (KC) является преобладающим типом клеток в эпидермисе, внешнем слое кожи. Эпидермальные КС играют решающую роль в обеспечении защиты кожи путем формирования неповрежденного кожного барьера против экологических оскорблений, таких как облучение UVB или патогенов, а также путем инициирования воспалительного ответа на эти оскорбления. Здесь мы описываем методы выделения КС из неонатальной кожи мыши и кожи взрослого мышиного хвоста. Мы также описываем условия культивирования с использованием определенных добавок роста (dGS) по сравнению с челюстной фетальной бычьей сывороткой (cFBS). Функционально мы показываем, что как новорожденные, так и взрослые KC очень чувствительны к терминальной дифференцировке с высоким кальцием, плотному образованию соединения и расслоению. Кроме того, культивируемые взрослые КС чувствительны к гибели клеток, вызванной UVB, и могут выделять большие количества TNF при облучении UVB. Вместе описанные здесь методы будут полезны исследователям для установки модели in vitroС для изучения эпидермальной биологии у неонатальной мыши и / или взрослого мыши.
Introduction
Кожа – самый большой орган в организме с эпидермисом как внешний слой. Эпидермис играет важную роль в формировании неповрежденного эпидермального барьера для отделения организма от окружающей среды и, таким образом, предотвращает потерю воды и обеспечивает защиту от экологических оскорблений, таких как аллергены, патогены и воздействие UVB. Эпидермис развивается из одного слоя недифференцированных базальных кератиноцитов (КС) в многослойный стратифицированный эпителий, состоящий из базального слоя с последующим остистым слоем, гранулированным слоем и роговым слоем. Базальные КС, состоящие как из эпидермальных стволовых клеток, так и транзиторно-амплифицирующих клеток, являются пролиферативными и недифференцированными. Поскольку базальные КЦ выходят из клеточного цикла, клетки совершают дифференцировку и постепенно мигрируют к поверхности эпидермиса, сопровождаясь созреванием переходов клеток-клеток и образованием барьера эпидермальной проницаемости (EPB). KCs на остистом слое экспрессируют ранние дифференцированныеИонные маркеры, такие как кератин 10 (K10); Когда КЦ мигрируют в гранулированный слой, клетки выражают маркеры поздней дифференцировки, такие как Филагрин (ФЛГ), Лорикрин (ЛОР) и Involucrin (INV). На роговом слое КС становятся терминально дифференцированными корнеоцитами, которые в конечном итоге исчезают через десквамацию, когда новые клетки заменяют их.
Кальций считается наиболее физиологическим агентом в эпидермисе и вызывает дифференцировку in vitro и in vivo аналогичным образом. В нормальном эпидермисе кожи ионы кальция образуют характерный «градиент концентрации», увеличиваясь в концентрации до поверхности кожи 1 , 2 , 3 . Концентрация кальция повышается с низких уровней в нижних подслоях (базальные и остистые слои) до пика в верхнем зернистом слое, а затем падает до незначительных уровней в самом поверхностном слое (роговой слой). Градиент кальция также развивается по совпадению с возникновением барьера компонентной проницаемости, который подтверждает, что сигнализация кальция играет критически важную роль дифференциации КЦ. In vitro низкий уровень кальция (0,02-0,1 мМ) поддерживает пролиферацию базальных КС в виде монослоя, тогда как высокий кальций (> 0,1 мМ) индуцирует быстрое и необратимое обязательство клеток к терминальной дифференцировке, что подтверждается образованием плотных соединений и индукцией LOR и INV при высокой обработке кальцием к базальным KC 4 , 5 .
Помимо образования барьеров, эпидермальные КС также являются важным компонентом врожденной иммунной системы кожи. В ответ на патогены или связанные с повреждением молекулярные структуры (DAMP), высвобождаемые при облучении или повреждении UVB, KC могут продуцировать большое количество воспалительных цитокинов, таких как TNFα, IL6 и IFNβ, что приводит к активации иммунной системы> 6 , 7 , 8 , 9 . Несмотря на то, собственно воспалительные сигнализации от KCS требуется для оформления патогена, неконтролируемая воспалительная реакция может вызвать развитие авто-воспалительных заболеваний кожи, таких как псориаз и розацеа 6, 8.
В целом, КЦ играют жизненно важную роль в поддержании неповрежденного кожного барьера и инициировании иммунного ответа на инвазию патогенов или экологических оскорблений. Поэтому первичная культура эпидермальных КЦ является полезной методикой для изучения эпителиальной биологии, дифференцировки КЦ, а также стимулированных КК врожденных иммунных реакций. Изоляция и культура первичных эпидермальных КЦ мышей могут быть сложным процессом из-за восприимчивости KC и чувствительности к различным внешним стимуляторам. Здесь мы описываем метод выделения и культивирования КС из кожи неонатальной мыши илиВзрослая кожа хвоста мыши. Для изоляции взрослых KC мы не используем дорсальную кожу мышей, так как выделение достаточного количества жизнеспособных КС из этой ткани может быть затруднено по следующим причинам: во-первых, взрослая спинная кожа на фазе покоя цикла волос (telogen) состоит из Тонкий эпидермис с только 1-2 слоями клеток, что приводит к низкому выходу клеток и неэффективному отделению эпидермиса от дермы, что является критическим шагом для успешной изоляции KC. Во-вторых, высокая плотность фолликулов волоса, которая присутствует на дорсальной коже взрослого, также способствует затруднению отделения эпидермиса от дермы. Вместо этого мы обычно используем кожу хвоста как источник для взрослых мышей KC, так как этот эпителий толще с 3-5 слоями эпидермальных КС. Он также имеет меньшую плотность фолликула волоса, который не мешает эпидермальному разделению, тем самым позволяя изолировать KC от любой взрослого мышечного хвоста кожи независимо от стадии развития век и волос мыши. Изолированная неонаТаль KC высевают в чашки с культивированным желатином, тогда как чашки с коллагеновым покрытием используются для высевания изолированных взрослых KC из-за нарушения способности взрослых клеток к адгезии по сравнению с их неонатальными аналогами. В культуральную мышь KC низкую кальциевую среду дополняют dGS, которая содержит эпидермальный фактор роста (EGF), бычий трансферрин, инсулиноподобный фактор ростаc1 (IGF1), простагландин E2 (PGE2), бычий сывороточный альбумин (BSA) и гидрокортизон. Через 2-4 дня после первоначального осаждения большинство дифференцированных KC можно смыть при ежедневных изменениях среды, а оставшиеся адгезивные клетки показывают типичную морфологию 4 булыжника, размножаются и не экспрессируют ранний дифференцировочный маркер K10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эпидермис кожи функционирует как критический барьер для отделения и защиты организма от внешней среды и повреждения от потери воды, патогенов, тепла и ультрафиолетового излучения. КЦ являются преобладающей клеточной линией эпидермиса, а первичная культура эпидермальных КС является ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантом НАЦИОНАЛЬНОГО ИНСТИТУТА АРТРИТА И МУСКУЛОСКЕЛЕЛЛА И КОЖИ (R01AR069653 Чжан ЛЖ) и Национальными институтами здравоохранения (5T32AR062496-03 – CA).
Materials
| C57BL/6 neonates or adult wildtype mice | Jackson Laboratory | 000664 | Wildtype mice (originally purchased from Jackson Laboratory) are breeded and maintained in animal vivarium at UCSD. |
| KC basal medium (EpiLife) | Invitrogen, Carlsbad, CA | MEPICF500 | basal medium for keratinocyte culture with 0.06 mM CaCl2 |
| Defined Growth Supplement (dGS) | Invitrogen, Carlsbad, CA | S0125 | defined growth supplements for culture medium |
| Dispase powder | Invitrogen, Carlsbad, CA | 17105041 | enzyme to dissociate the epidermis from dermis |
| Attachment Factor | Invitrogen, Carlsbad, CA | S006100 | gelatin-based coating material |
| Coating Matrix | Invitrogen, Carlsbad, CA | R011K | Collagen-based coating material |
| TrypLE | Invitrogen, Carlsbad, CA | 12604-013 | A gentle trypsin-like enzyme to dissociate keratinocytes from epidermal sheet |
| 100 μm Cell Strainer Nylon mesh | Corning | 352360 | |
| CCK-8 cell viability Kit | Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD | CK04-11 | |
| Mouse TNF (Mono/Mono) ELISA Set II | BD Biosciences, San Jose, CA | 555268 | |
| Corded Hand-Held UV Lamps | Spectronics, Westbury, NY | EB-280C | |
| 8-watt UV tubes | Spectronics, Westbury, NY | BLE-8T312 | |
| Light Inverted Microscope for cell culture | ZEISS, Jena, Germany | Axio Observer | |
| Fluorescent Microscope | Olympus | BX41 |
References
- Mauro, T., et al. Acute barrier perturbation abolishes the Ca2+ and K+ gradients in murine epidermis: quantitative measurement using PIXE. J Invest Dermatol. 111 (6), 1198-1201 (1998).
- Menon, G. K., Grayson, S., Elias, P. M. Ionic calcium reservoirs in mammalian epidermis: ultrastructural localization by ion-capture cytochemistry. J Invest Dermatol. 84 (6), 508-512 (1985).
- Elias, P. M., et al. Formation of the epidermal calcium gradient coincides with key milestones of barrier ontogenesis in the rodent. J Invest Dermatol. 110 (4), 399-404 (1998).
- Hennings, H., et al. Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture. Cell. 19 (1), 245-254 (1980).
- Zhang, L. J., Bhattacharya, S., Leid, M., Ganguli-Indra, G., Indra, A. K. Ctip2 is a dynamic regulator of epidermal proliferation and differentiation by integrating EGFR and Notch signaling. J Cell Sci. 125 (Pt 23), 5733-5744 (2012).
- Lai, Y. P., et al. Commensal bacteria regulate Toll-like receptor 3-dependent inflammation after skin injury. Nat Med. 15 (12), 1377-1382 (2009).
- Bernard, J. J., et al. Ultraviolet radiation damages self noncoding RNA and is detected by TLR3. Nat Med. 18 (8), (2012).
- Zhang, L. J., et al. Antimicrobial Peptide LL37 and MAVS Signaling Drive Interferon-beta Production by Epidermal Keratinocytes during Skin Injury. Immunity. 45 (1), 119-130 (2016).
- Borkowski, A. W., et al. Toll-Like Receptor 3 Activation Is Required for Normal Skin Barrier Repair Following UV Damage. J Invest Dermatol. 135 (2), 569-578 (2015).
- Borkowski, A. W., et al. Toll-like receptor 3 activation is required for normal skin barrier repair following UV damage. J Invest Dermatol. 135 (2), 569-578 (2015).
- Zillessen, P., et al. Metabolic role of dipeptidyl peptidase 4 (DPP4) in primary human (pre)adipocytes. Sci Rep. 6, 23074 (2016).
- Wells, C. A., et al. The macrophage-inducible C-type lectin, mincle, is an essential component of the innate immune response to Candida albicans. J Immunol. 180 (11), 7404-7413 (2008).
- Vasioukhin, V., Bauer, C., Yin, M., Fuchs, E. Directed actin polymerization is the driving force for epithelial cell-cell adhesion. Cell. 100 (2), 209-219 (2000).
- Zhuang, L., et al. TNF receptor p55 plays a pivotal role in murine keratinocyte apoptosis induced by ultraviolet B irradiation. J Immunol. 162 (3), 1440-1447 (1999).
- Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nat Protoc. 3 (5), 799-810 (2008).
- Dlugosz, A. A., Glick, A. B., Tennenbaum, T., Weinberg, W. C., Yuspa, S. H. Isolation and utilization of epidermal keratinocytes for oncogene research. Methods Enzymol. 254, 3-20 (1995).
- Jones, J. C. Isolation and culture of mouse keratinocytes. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Pirrone, A., Hager, B., Fleckman, P. Primary mouse keratinocyte culture. Methods Mol Biol. 289, 3-14 (2005).
- Yuspa, S. H., Kilkenny, A. E., Steinert, P. M., Roop, D. R. Expression of murine epidermal differentiation markers is tightly regulated by restricted extracellular calcium concentrations in vitro. J Cell Biol. 109 (3), 1207-1217 (1989).
- Yuspa, S. H., et al. Signal transduction for proliferation and differentiation in keratinocytes. Ann N Y Acad Sci. 548, 191-196 (1988).
- Fang, N. X., et al. Calcium enhances mouse keratinocyte differentiation in vitro to differentially regulate expression of papillomavirus authentic and codon modified L1 genes. Virology. 365 (1), 187-197 (2007).
- Kolly, C., Suter, M. M., Muller, E. J. Proliferation, cell cycle exit, and onset of terminal differentiation in cultured keratinocytes: pre-programmed pathways in control of C-Myc and Notch1 prevail over extracellular calcium signals. J Invest Dermatol. 124 (5), 1014-1025 (2005).
- Marcelo, C. L., Gold, R. C., Fairley, J. A. Effect of 1.2 mmol/l calcium, triamcinolone acetonide, and retinoids on low-calcium regulated keratinocyte differentiation. Br J Dermatol. 111, 64-72 (1984).
