Isolierung und Kultur der primären Maus Keratinozyten aus neonatalen und erwachsenen Maus Haut
Summary
Epidermale Keratinozyten bilden eine funktionelle Hautbarriere und sind an der Frontlinie der Wirtsverteidigung gegen äußere Umweltbeleidigungen positioniert. Hier beschreiben wir Methoden zur Isolierung und Primärkultur von epidermalen Keratinozyten aus neonataler und erwachsener Maushaut und Induktion der terminalen Differenzierung und UVB-ausgelösten Entzündungsreaktionen von Keratinozyten.
Abstract
Der Keratinozyt (KC) ist der vorherrschende Zelltyp in der Epidermis, der äußersten Schicht der Haut. Epidermale KCs spielen eine entscheidende Rolle bei der Bereitstellung von Hautverteidigung durch die Bildung einer intakten Hautbarriere gegen Umwelt-Beleidigungen, wie UVB-Bestrahlung oder Pathogene, und auch durch die Einleitung einer entzündlichen Reaktion auf diese Beleidigungen. Hier beschreiben wir Methoden, um KCs von der neonatalen Maushaut und von der erwachsenen Mausschwanzhaut zu isolieren. Wir beschreiben auch Kultivierungsbedingungen mit definierten Wachstumsergänzungen (dGS) im Vergleich zu Chelex-fötalem Rinderserum (cFBS). Funktionell zeigen wir, dass sowohl neonatale als auch erwachsene KCs in hohem Maße auf eine hohe Calcium-induzierte terminale Differenzierung, eine enge Kreuzungsbildung und -schichtung ansprechen. Darüber hinaus sind kultivierte erwachsene KCs anfällig für UVB-ausgelösten Zelltod und können große Mengen an TNF bei UVB-Bestrahlung freisetzen. Gemeinsam sind die hier beschriebenen Methoden für Forscher für den Aufbau des In-vitro- Modells von NutzenS, um die epidermale Biologie in der neonatalen Maus und / oder der erwachsenen Maus zu studieren.
Introduction
Die Haut ist das größte Organ im Körper mit der Epidermis als die äußerste Schicht. Die Epidermis spielt eine entscheidende Rolle bei der Bildung einer intakten epidermalen Barriere, um den Körper von der Umwelt zu trennen und verhindert so Wasserverlust und schützt vor Umweltbeleidigungen wie Allergenen, Krankheitserregern und UVB-Exposition. Die Epidermis entwickelt sich aus einer einzigen Schicht von undifferenzierten basalen Keratinozyten (KCs) zu einem mehrschichtigen, geschichteten Epithel, bestehend aus einer Basalschicht, gefolgt von einer Dornschicht, einer körnigen Schicht und einem Stratum corneum. Basale KCs, bestehend aus epidermalen Stammzellen und transitverstärkenden Zellen, sind proliferativ und undifferenziert. Da die Basal-KCs den Zellzyklus verlassen, begehen die Zellen der Differenzierung und wandern allmählich zur Oberfläche der Epidermis, begleitet von der Reifung von Zellzellübergängen und der Bildung einer epidermalen Permeabilitätsbarriere (EPB). Die KCs an der Dornschicht drücken früh differenz ausIonenmarker wie Keratin 10 (K10); Wenn die KCs zur körnigen Schicht wandern, exprimieren die Zellen späte Differenzierungsmarker wie Filaggrin (FLG), Loricrin (LOR) und Involucrin (INV). Bei dem Stratum corneum werden die KCs endlich differenzierte Corneozyten, die schließlich durch Abschuppung abgebaut werden, da neue Zellen sie ersetzen.
Calcium gilt als das physiologischste Mittel in der Epidermis und löst die Differenzierung in vitro und in vivo in ähnlicher Weise aus. Bei normaler Hautepidermis bilden Calciumionen einen charakteristischen "Konzentrationsgradienten", der sich in der Konzentration auf die Hautoberfläche 1 , 2 , 3 erhöht. Die Calciumkonzentration steigt von niedrigen Niveaus in den untersten Teilschichten (Basal- und Dornschichten) bis zu einem Peak in der oberen Granulatschicht und fällt dann in der oberflächlichen Schicht (Stratum corneum) zu vernachlässigbaren Niveaus. Der Kalziumgradient entwickelt sich auch zufällig mit der Entstehung einer Komponentenpermeabilitätsbarriere, die die Calcium-Signalisierung eine kritische Rolle der KC-Differenzierung spielt. In vitro behält das niedrige Kalzium (0,02-0,1 mM) die Proliferation von basalen KCs als Monoschicht bei, während ein hohes Kalzium (> 0,1 mM) eine rasche und irreversible Verpflichtung der Zellen zur terminalen Differenzierung induziert, wie durch eine enge Kreuzung und Induktion gezeigt wird Von LOR und INV bei hoher Kalziumbehandlung zu den basalen KCs 4 , 5 .
Neben der Barrierebildung sind auch epidermale KCs ein wichtiger Bestandteil des angeborenen Immunsystems der Haut. Als Reaktion auf Pathogene oder beschädigte assoziierte molekulare Muster (DAMPs), die bei UVB-Bestrahlung oder Verletzung freigesetzt werden, können KCs große Mengen an entzündlichen Zytokinen wie TNF & agr ;, IL 6 und IFN & bgr; erzeugen, was zu einer Aktivierung des Immunsystems führt> 6 , 7 , 8 , 9 Obwohl eine korrekte entzündliche Signalisierung von KCs für die Pathogen-Clearance erforderlich ist, kann eine unkontrollierte Entzündungsreaktion die Entwicklung von entzündungshemmenden Hauterkrankungen wie Psoriasis und Rosacea 6 , 8 auslösen.
Insgesamt spielen KCs eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der intakten Hautbarriere und initiieren eine Immunantwort auf Pathogeninvasion oder Umweltbeleidigungen. Daher ist die primäre Kultur der epidermalen KCs eine nützliche Technik, um die Epithelbiologie, KC-Differenzierung sowie KC-stimulierte angeborene Immunantworten zu untersuchen. Die Isolierung und Kultur der primären Maus epidermalen KCs kann ein anspruchsvoller Prozess aufgrund der KC-Anfälligkeit und Empfindlichkeit gegenüber verschiedenen externen Stimulanzien sein. Hier beschreiben wir eine Methode zur Isolierung und Kultur von KCs aus der neonatalen Maushaut oderErwachsene Maus Schwanz Haut. Für die erwachsene KC-Isolation verwenden wir keine Maus-Dorsal-Haut, da die Isolierung von ausreichenden Mengen an lebensfähigen KCs aus diesem Gewebe aus folgenden Gründen schwierig sein kann: Erstens besteht die erwachsene Dorsalhaut in der Ruhephase des Haarzyklus (Telogen) aus a Dünne Epidermis mit nur 1-2 Schichten von Zellen, was zu einer niedrigen Zelle Ausbeute und ineffiziente Trennung der Epidermis aus der Dermis, die der kritische Schritt für eine erfolgreiche KC-Isolation ist. Zweitens trägt die hohe Haarfollikeldichte, die auf der erwachsenen Dorsalhaut vorhanden ist, weiter zur Schwierigkeit bei der Trennung der Epidermis von der Dermis bei. Stattdessen verwenden wir routinemäßig die Schwanzhaut als Quelle für erwachsene Maus-KCs, da dieses Epithel mit 3-5 Schichten epidermalen KCs dicker ist. Es hat auch eine niedrigere Haarfollikel-Dichte, die nicht mit der epidermalen Trennung stört, so dass KC-Isolierung von jeder erwachsenen Maus Schwanz Haut unabhängig von der Alter und Haare Radfahren Stadium der Maus. Die isolierte neonaTal KCs werden zu gelatinebeschichteten Kulturschalen ausgesät, während kollagenbeschichtete Schalen verwendet werden, um isolierte erwachsene KCs zu säen, da die beeinträchtigten Fähigkeiten der erwachsenen Zellen im Vergleich zu ihren neonatalen Gegenstücken haften. Zur Kombination von Maus-KCs wird ein niedriges Calcium-Basalmedium mit dGS ergänzt, das epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), Rindertransferrin, Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor c1 (IGF1), Prostaglandin E2 (PGE2), Rinderserumalbumin (BSA) und Hydrocortison enthält. Zwischen 2-4 Tagen nach der anfänglichen Beschichtung können die meisten der differenzierten KCs während der täglichen mittleren Veränderungen weggewaschen werden, und die verbleibenden adhärenten Zellen zeigen eine typische Kopfsteinmorphologie 4 , sind proliferierend und exprimieren nicht den frühen Differenzierungsmarker K10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Haut-Epidermis fungiert als eine kritische Barriere, um den Körper von der äußeren Umgebung zu trennen und zu schützen und Schäden durch Wasserverlust, Krankheitserreger, Hitze und UV-Bestrahlung. Die KCs sind die vorherrschende Zelllinie der Epidermis, und die Primärkultur der epidermalen KCs ist ein nützliches Werkzeug, um die biologischen Prozesse der Barrierebildung und die Reaktion von KCs auf Umweltbeleidigungen in vitro zu untersuchen und zu verstehen.
Hier beschre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von NATIONAL INSTITUTE OF ARTHRITIS UND MUSKULOSKELETAL UND HAUTKRANKHEITEN gewährt (R01AR069653 bis Zhang LJ) und National Institutes of Health Support (5T32AR062496-03 bis CA).
Materials
| C57BL/6 neonates or adult wildtype mice | Jackson Laboratory | 000664 | Wildtype mice (originally purchased from Jackson Laboratory) are breeded and maintained in animal vivarium at UCSD. |
| KC basal medium (EpiLife) | Invitrogen, Carlsbad, CA | MEPICF500 | basal medium for keratinocyte culture with 0.06 mM CaCl2 |
| Defined Growth Supplement (dGS) | Invitrogen, Carlsbad, CA | S0125 | defined growth supplements for culture medium |
| Dispase powder | Invitrogen, Carlsbad, CA | 17105041 | enzyme to dissociate the epidermis from dermis |
| Attachment Factor | Invitrogen, Carlsbad, CA | S006100 | gelatin-based coating material |
| Coating Matrix | Invitrogen, Carlsbad, CA | R011K | Collagen-based coating material |
| TrypLE | Invitrogen, Carlsbad, CA | 12604-013 | A gentle trypsin-like enzyme to dissociate keratinocytes from epidermal sheet |
| 100 μm Cell Strainer Nylon mesh | Corning | 352360 | |
| CCK-8 cell viability Kit | Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD | CK04-11 | |
| Mouse TNF (Mono/Mono) ELISA Set II | BD Biosciences, San Jose, CA | 555268 | |
| Corded Hand-Held UV Lamps | Spectronics, Westbury, NY | EB-280C | |
| 8-watt UV tubes | Spectronics, Westbury, NY | BLE-8T312 | |
| Light Inverted Microscope for cell culture | ZEISS, Jena, Germany | Axio Observer | |
| Fluorescent Microscope | Olympus | BX41 |
References
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