زرع الخلايا البدائية كريسبر/Cas9-تعتمد قفزات واسعة في النمو
Summary
الجينات الأساسية للبقاء على قيد الحياة تشكل عقبات تقنية لإنشاء خطوط المسخ. قفزات واسعة تلتف الفتك بالجمع بين الجينوم التحرير مع زرع الخلايا البدائية خلق الحيوانات البرية من نوع تحمل طفرات الخط. قفزات واسعة ويسمح أيضا بكفاءة توليد طفرات فارغة متماثل في الجيل1 و. ويتجلى هنا، خطوة الزرع.
Abstract
هو التعجيل بإنشاء خطوط متحولة عن طريق تحرير الجينوم التحليل الجيني في العديد من الكائنات الحية. أساليب كريسبر/Cas9 وقد تم تكييف للاستخدام في الضفدع المخالب الأفريقية، النمو، كائن طراز القديم للبحوث الطبية الحيوية. وقد نظم التربية التقليدية لخلق خطوط متحولة متماثل مع الطفرات كريسبر/Cas9–استهدفت عدة خطوات شاقة وتستغرق وقتاً طويلاً. تيسيرا تخليق أجنة متحولة، لا سيما التغلب على العقبات المرتبطة بانقطاع الجينات التي لا غنى عنها ل embryogenesis، وضعت طريقة جديدة تسمى قفزات واسعة. هذا الأسلوب روافع متانة النمو الأجنة “قص ولصق” أساليب الجنينية. قفزات واسعة يستخدم نقل الخلايا الجرثومية الأساسية (بجكس) من الأجنة موتاجينيزيد كفاءة الجهات المانحة إلى الأخوة والأخوات أبلاتيد PGC wildtype. يسمح هذا الأسلوب للطفرة كفاءة الجينات الأساسية عن طريق إنشاء تشيميريك الحيوانات مع خلايا جسدية wildtype التي تحمل الفعل المسخ. عندما تقل اثنين من الحيوانات0 و “زرع قفز” هي إينتيركروسيد (أي، متحولة الخلايا الجرثومية)، وأنها تنتج متماثل، أو مجمع متخالف، فارغة و1 الأجنة، مما يوفر وقت جيل كامل للحصول على البيانات المظهرية. قفزات واسعة كما يوفر نهجاً جديداً لتحليل الجينات تأثير الأم، التي صهر لتحليل المظهرية0 و بعد الطفرات كريسبر/Cas9. هذه المخطوطة تفاصيل أسلوب القفزات، مع التركيز بوجه خاص على كيفية إجراء زرع PGC بنجاح.
Introduction
وقد كيف بالنمط الوراثي ترميز النمط الظاهري مسألة رئيسية في علم الأحياء منذ إعادة اكتشاف قوانين مندل. فهم أدوار الجينات وتنظيمها والتفاعلات داخل شبكات الجينات، ووظائف المنتجات المشفرة بالوعود تقديم أدوات للكشف عن الأحياء الجديدة وتحسين المرض الدول. لأكثر من نصف قرن1، كان الضفدع الأفريقية المخالب، النمو، نموذجا رائدا للدراسات بشأن طائفة واسعة من المواضيع في البيولوجيا الأساسية والطب الحيوي، بما في ذلك عنصر التحكم الوراثي للتنمية. تاريخيا، استخدمت معظم البحوث بشأن النمو الضفدع اللوتيترابلويد، X. laevis، ولكن في الآونة الأخيرة، وضعت بسبب ما ديبلويدي، X. tropicalis كنموذج وراثية البرمائية. وقد تم تجميع تسلسل الجينوم الكامل من كل الأنواع النمو 2،3. “المجتمع الضفدع” الآن في نقطة تحول حيث تسمح تقنية تعديل الجينوم الأساسي دراسة وظيفة الجينات، وتقريبا في الإرادة. برمجة كريسبر/Cas9 اندونوكليسيس جعلت الطفرات الجينات ذات كفاءة عالية، مع الطفرة بياليليك ممكن في معظم الخلايا الحيوانية4،5،،من67، 8،9،،من1011. هذه الدراسات، وأبرز بهاتاشاريا et al. 12 وشيجيتا et al. 13، قد أظهرت أن الدالة العديد من الجينات يمكن أن يدرسها الطفرات في و0 فسيفساء الحيوانات. وهذا النهج له العديد من المزايا؛ ومع ذلك، عرض الأجنة Cas9-سجرنا-ميكروينجيكتيد غالباً ما تعمل متغير بسبب فقدان وظيفة (LOF) غير مكتملة. الأهم من ذلك، توليد خطوط متحولة مفيد جداً لبعض التطبيقات – وبخاصة عند دراسة الجينات التي لها مساهمة مرناً النفاسية. مرناس الأمهات والبروتينات، وتأثيراتها على التخلق، تستمر لفترة طويلة في امبريوجينيسيس14،،من1516، تقديم المساهمات الإنمائية المبكرة العديد من الجينات صهر للتحليلات و0 . ولذلك، نهج LOF أخرى مطلوبة.
عندما تسعى إلى إنشاء خطوط متحولة، والمسار للحصول على الأجنة LOF متماثل قد عدة عقبات. يمكن أن تكون الطفرات أولاً، تتسم بالكفاءة لإنتاج طفرات بياليليك غير ملائم نظراً لفقدان وظائف الجينات الأساسية يؤدي إلى الفشل في البقاء على قيد الحياة إلى مرحلة النضج الجنسي، تتداخل مع إنتاج خط قابلة للحياة. حل مشترك هو المعايرة الدقيق مقدار Cas9-سجرنا تسليمها. هنا، أن الهدف تحقيق توازن بين خفض الفتك مع تعظيم كفاءة الطفرات germline أيضا. ظهرت مشكلة ثانية من نظام تربية قياسية، حيث يتم تأجيل تحليلات المظهرية إلى الجيل2 و. استخدام النهج الموحدة، ناضجة جنسياً و0 الحيوانات التي تنقل المسخ الآليلات من خلال الخط يتم أووتكروسيد لإنتاج و1 متخالف “ناقلات”، التي تزرع ثم إلى مرحلة النضج الجنسي. ثم يتم إينتيركروسيد اثنين heterozygotes1 و إنتاج و2 أجنة المسخ في تردد مندلية المتوقعة بنسبة 25%. وهكذا، جيلين تربية ضرورية لتحليل تعمل المسخ. يمكن أن تكون الحيوانات المسخ homozygotes أو heterozygotes المركب (أي ذرية تحتوي على اثنين من الآليلات المختلفة المسخ، الذي يعتمد على الأنماط الجينية للحيوانات الأبوية المستخدمة في إينتيركروس1 و).
ويمكن التغلب على هذه العقبات بقصره للبرمجة نوكلاس بوساطة الطفرات في الخلايا الجرثومية، الذي يكمن وراء طريقة جديدة تسمى الوثب17. قفزات واسعة بعنصرين رئيسيين هما: (1) microinjection مرناً Cas جنبا إلى جنب مع سجرنا، أو مجمعات سجرنا nuclease (أو في مبدأ أو تالينس أو الزنك nucleases الإصبع) مرحلة وحيدة الخلية كفاءة موتاجينيزي الجينوم الجنينية، تليها (2) زرع بجكس إلى أجنة الأخوة wildtype، حيث أزيلت بجكس الذاتية. يمكن الحصول على كل الخطوات عند استبدال الخط كاملة، وكفاءة مع الخلايا الجرثومية المسخ. أظهر بلاكلير في أوائل الستينات أن يمكن زرع بجكس النمو بين الأجنة في نارولا الراحل وأوائل تايلبود مراحل18،19. للقفزات، تعديل النهج الذي بلاكلير بالقيام عمليات الزرع في مرحلة البلاستولا17، عندما يتم ترجمة بجكس في القطب فيجيتال20،الجنين21. وقد زرع قبل gastrulation اثنين من المزايا الرئيسية. أولاً، تم العثور على انجرافتمينت لعمليات زرع الأعضاء والتطور الطبيعي اللاحقة لتكون أكثر فعالية عندما يتم زرع الأعضاء في مرحلة البلاستولا (الملاحظات غير منشورة). ثانيا، عن طريق إجراء عمليات الزرع في مرحلة البلاستولا بعد وقت قصير من النسخ زيجوتيك وقد بدأ، واحد تجنب الفتك الناشئة عن الجينات الإنمائية الطفرات التي تعطل gastrulation أو خلاف ذلك يؤدي إلى تالف نارولا أواخر. وتزرع PGC الحاملة لزرع الأجنة (“تخطي”) إلى مرحلة النضج الجنسي، وإينتيركروسيس بين هذه الحيوانات0 و قد أثبتت أنه في كثير من الحالات، عرض 100 ٪ ذرية1 و النمط الظاهري LOF (معظم يجري مجمع heterozygotes)، التي تشير إلى استبدال الخط كاملة مع التحولات المستهدفة.
ومن المتوقع أن القفزات سوف تعجل بالنهج الوراثية في النمو. قفزات واسعة كما يوفر بديلاً ل أسلوب “مضيفة نقل”22 لتحليل LOF للأمهات تأثير الجينات (الملاحظات غير منشورة). في المنشور الحالي، يرد وصف مفصل للطريقة، وتركز بصفة خاصة على زرع PGC، في X. tropicalis (مع تعديلات طفيفة ل X. laevis). ويتجلى زرع بجكس هنا لتسهيل نقل هذه التكنولوجيا أكثر سرعة إلى مختبرات أخرى تعمل مع النمو. ينبغي أن تكون مبادئ هذا الأسلوب الناجح في البرمائيات الأخرى (مثلاً، أوروديليس)، والتعديلات الخاصة بالكائن الحي في المنهجية التي ينبغي أن تسمح بالتطبيق للعديد من الحيوانات الأخرى التي يمكن تحقيق كفاءة الطفرات و بجكس سهولة الأولى.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويقدم هذا التقرير يستخدم بروتوكول مفصل لزرع الأنسجة النباتية التي تحتوي على بجكس-“زرع الأعضاء من بجكس” بالتزامن مع تحرير الجينوم التكنولوجيات (مثل، كريسبر/Cas9) لتعديل الفعل حيوان بينما الحفاظ على ما يقرب من جميع الأنسجة الجسدية، كنوع البرية وراثيا. لتجاوز المراحل لتكون ناجحة، هناك عد?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
أنجز هذا العمل بالدعم من منحة، 5R21HD080684-02، من المعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية. المؤلف يود أن يشكر شو كين للحماس المتواصل ودعمه. صاحب البلاغ أيضا تود أن تقر بلومبرغ بروس لاستخدام آلة التصوير، “ربيكا شارني”، لقراءة نقدية للمخطوطات، وشون مكنمارا ومارسين وليزلا في المورد النمو الوطني (RRID:SCR_013731)، لقيمة المحادثات المتعلقة بتغذية X. tropicalis ونظم الرعاية الحيوانية.
Materials
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 or 11252-30 | |
| Eyebrow hair knife | Homemade | ||
| Hair loop | Homemade | ||
| Pasteur pipettes, borosilicate glass | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Krazy Glue (Cyanoacrylate-based) | Elmer's Products, Inc. | KG581 | To affix eyebrow hair and hair loops into Pasteur pipettes, other similar glues can be used. |
| Oligodeoxynucleotides, custom ordered | Integrated DNA Technologies | Custom ordered | Template oligos for sgRNA synthesis, see Nakayama et al., 2014 for design details. |
| Megascript T7 kit | Ambion/ThermoFisher | AM1334 | Or use Megashortscript T7 (AM1354) kit |
| Phenol, Tris buffered | High quality distilled phenol from any commercial supplier | ||
| Chloroform | High quality chloroform from any commercial supplier | ||
| Ethanol | High quality ethanol from any commercial supplier | ||
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma Chemical Co. | D5758-50ML | |
| Cas9 protein, with nuclear localization signal | PNA Bio, Inc. | CP01 | Reconstituted using DEPC-treated water according to manufacturer's recommendations |
| 10X Marc's Modified Ringers solution | Homemade. Recipe (ref 26) for 1X MMR (lacking EDTA) is 100mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES. Solution is pH adjusted to 7.4. | ||
| Agarose | Any Molecular Biology grade agarose is sufficient | ||
| 60 X15 mm Petri plates | Falcon | 351007 | |
| 24-well plates | Falcon | 3047 | |
| L-Cysteine | Sigma Chemical Co. | C7352-100G | Free base, not HCl salt |
| Proteinase K | Roche | 03 115 828 001 | Typically ~20mg/ml from Roche |
| sera Micron | sera | Tadpole food. Resuspend in growth medium. Can be purchased from a variety of online retailers |
Referências
- Gurdon, J. B., Hopwood, N. The introduction of Xenopus laevis into developmental biology: of empire, pregnancy testing and ribosomal genes. Int J Dev Biol. 44 (1), 43-50 (2000).
- Hellsten, U., et al. The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis. Science. 328 (5978), 633-636 (2010).
- Session, A. M., et al. Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis. Nature. 538 (7625), 336-343 (2016).
- Blitz, I. L., Biesinger, J., Xie, X., Cho, K. W. Biallelic genome modification in F(0) Xenopus tropicalis embryos using the CRISPR/Cas system. Genesis. 51 (12), 827-834 (2013).
- Nakayama, T., Fish, M. B., Fisher, M., Oomen-Hajagos, J., Thomsen, G. H., Grainger, R. M. Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis. Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).
- Guo, X., et al. Efficient RNA/Cas9-mediated genome editing in Xenopus tropicalis. Development. 141 (3), 707-714 (2014).
- Wang, F., Shi, Z., Cui, Y., Guo, X., Shi, Y. B., Chen, Y. Targeted gene disruption in Xenopus laevis using CRISPR/Cas9. Cell Biosci. 5, 15 (2015).
- Jaffe, K. M., et al. c21orf59/kurly Controls Both Cilia Motility and Polarization. Cell Rep. 14 (8), 1841-1849 (2016).
- Liu, Z., et al. Efficient genome editing of genes involved in neural crest development using the CRISPR/Cas9 system in Xenopus embryos. Cell Biosci. 6, 22 (2016).
- Naert, T., et al. CRISPR/Cas9 mediated knockout of rb1 and rbl1 leads to rapid and penetrant retinoblastoma development in Xenopus tropicalis. Sci Rep. 6 (35264), (2016).
- Ratzan, W., Falco, R., Salanga, C., Salanga, M., Horb, M. E. Generation of a Xenopus laevis F1 albino J strain by genome editing and oocyte host-transfer. Dev Biol. 426 (2), (2016).
- Bhattacharya, D., Marfo, C. A., Li, D., Lane, M., Khokha, M. K. CRISPR/Cas9: An inexpensive, efficient loss of function tool to screen human disease genes in Xenopus. Dev Biol. 408 (2), 196-204 (2015).
- Shigeta, M., et al. Rapid and efficient analysis of gene function using CRISPR-Cas9 in Xenopus tropicalis founders. Genes Cells. 21 (7), 755-771 (2016).
- Hontelez, S., et al. Embryonic transcription is controlled by maternally defined chromatin state. Nat Commun. 6, 10148 (2015).
- Peshkin, L., et al. On the Relationship of Protein and mRNA Dynamics in Vertebrate Embryonic Development. Dev Cell. 35 (3), 383-394 (2015).
- Owens, N. D., et al. Measuring Absolute RNA Copy Numbers at High Temporal Resolution Reveals Transcriptome Kinetics in Development. Cell Rep. 14 (3), 632-647 (2016).
- Blitz, I. L., Fish, M. B., Cho, K. W. Leapfrogging: primordial germ cell transplantation permits recovery of CRISPR/Cas9-induced mutations in essential genes. Development. 143 (15), 2868-2875 (2016).
- Blackler, A. W. Transfer of germ-cells in Xenopus laevis. Nature. 185, 859-860 (1960).
- Blackler, A. W., Fischberg, M. Transfer of primordial germ-cells in Xenopus laevis. J Embryol. Exp Morph. 9, 634-641 (1961).
- Bounoure, L. . L’origine des cellules reproductrices et le problem de la lignee germinale. , (1939).
- Nieuwkoop, P. D., Sutasurya, L. A. . Primordial Germ Cells in the Chordates: Embryogenesis and phylogenesis. , (1979).
- Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. C. Fertilization of cultured Xenopus oocytes and use in studies of maternally inherited molecules. Methods Cell Biol. 36, 213-230 (1991).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Embryo dissection and micromanipulation tools. CSH Protoc. , (2007).
- Nakayama, T., et al. Cas9-based genome editing in Xenopus tropicalis. Methods Enzymol. 546, 355-375 (2014).
- Ogino, H., McConnell, W. B., Grainger, R. M. High-throughput transgenesis in Xenopus using I-SceI meganuclease. Nat Protoc. 1 (4), 1703-1710 (2006).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early development of Xenopus laevis.: a laboratory manual. , (2000).
- Kay, B. K., Kay, B. K., Peng, H. B. Injection of oocytes and embryos. Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology (Methods in Cell Biology Vol. 36). , (1991).
- Nieuwkoop, P., Faber, J. . Normal Table of Xenopus laevis. (Daudin): A Systematical and Chronological Survey of the Development from the Fertilized Egg till the End of Metomorphosis. , (1994).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Res. 42 (22), e168 (2014).
- Sander, V., Reversade, B., De Robertis, E. M. The opposing homeobox genes Goosecoid and Vent1/2 self-regulate Xenopus patterning. EMBO J. 26 (12), 2955-2965 (2007).
- Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
- Kim, J. M., Kim, D., Kim, S., Kim, J. S. Genotyping with CRISPR-Cas-derived RNA-guided endonucleases. Nat Commun. 5, 3157 (2014).
- Kim, H. J., Lee, H. J., Kim, H., Cho, S. W., Kim, J. S. Targeted genome editing in human cells with zinc finger nucleases constructed via modular assembly. Genome Res. 19 (7), 1279-1288 (2009).
- Qiu, P., Shandilya, H., D’Alessio, J. M., O’Connor, K., Durocher, J., Gerard, G. F. Mutation detection using Surveyor nuclease. Biotechniques. 36 (4), 702-707 (2004).
- Ota, S., et al. Efficient identification of TALEN-mediated genome modifications using heteroduplex mobility assays. Genes Cells. 18 (6), 450-458 (2013).
- Dahlem, T. J., et al. Simple Methods for Generating and Detecting Locus- Specific Mutations Induced with TALENs in the Zebrafish Genome. PLoS Genet. 8 (8), e1002861 (2012).
- Ramlee, M. K., Yan, T., Cheung, A. M., Chuah, C. T., Li, S. High-throughput genotyping of CRISPR/Cas9-mediated mutants using fluorescent PCR-capillary gel electrophoresis. Sci Rep. 5, 15587 (2015).
- Bhattacharya, D., Marfo, C. A., Li, D., Lane, M., Khokha, M. K. CRISPR/Cas9: An inexpensive, efficient loss of function tool to screen human disease genes in Xenopus. Dev Biol. 408 (2), 196-204 (2015).
- Yu, C., Zhang, Y., Yao, S., Wei, Y. A PCR Based Protocol for Detecting Indel Mutations Induced by TALENs and CRISPR/Cas9 in Zebrafish. PLoS ONE. 9 (6), e98282 (2014).
- Mock, U., Hauber, I., Fehse, B. Digital PCR to assess gene-editing frequencies (GEF-dPCR) mediated by designer nucleases. Nat Protoc. 11 (3), 598-615 (2016).
- Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).
- Shi, J., Wang, E., Milazzo, J. P., Wang, Z., Kinney, J. B., Vakoc, C. R. Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains. Nat Biotechnol. 33 (6), 661-667 (2015).
- Koebernick, K., Loeber, J., Arthur, P. K., Tarbashevich, K., Pieler, T. Elr-type proteins protect Xenopus Dead end mRNA from miR-18-mediated clearance in the soma. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 16148-16153 (2010).
- Yang, J., Aguero, T., King, M. L. The Xenopus maternal-to-zygotic transition from the perspective of the germline. Curr Top Dev Biol. 113, 271-303 (2015).
