Genes essenciais para a sobrevivência colocam obstáculos técnicos para a criação de linhas de mutantes. Saltos contorna a letalidade combinando genoma edição com transplante de células de germes primordial para criar animais selvagem-tipo carregando mutações do germline. Saltos também permite a geração eficiente de homozigotos mutantes nulos na geração1 F. Aqui, o passo de transplante é demonstrado.
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Artigo de método
Transplante de células de germes primordial para baseado em CRISPR/Cas9 saltos em Xenopus
Neste artigo
Resumo
Resumo
A criação de linhas de mutante editando genoma está acelerando a análise genética em muitos organismos. CRISPR/Cas9 métodos foram adaptados para o uso na africana Xenopus, Xenopus, um organismo de longa data modelo para investigação biomédica. Os regimes tradicionais de reprodução para criar linhas mutantes homozigotos com mutagénese CRISPR/Cas9-alvo têm várias etapas demoradas e trabalhosas. Para facilitar a criação de embriões mutantes, particularmente para superar os obstáculos associados a bater para fora os genes que são essenciais para a embriogênese, foi desenvolvido um novo método chamado saltos. Esta técnica utiliza a robustez dos embriões de Xenopus "cortar e colar" métodos embriológicos. Saltos utiliza a transferência de células germinativas primordiais (PGCs) de embriões de doador de forma eficiente-mutagenized em sua PGC-ablated irmãos. Este método permite a eficiente mutação de genes essenciais criando animais quiméricoes com sua células somáticas que carregam uma mutante da linha germinal. Quando dois animais de0 F carregando "saltar transplantes" (isto é, células germinativas mutante) são intercrossed, eles produzem homozigotos, ou compostos heterozigotos, nulos F1 embriões, economizando assim um tempo de geração completo para obter dados fenotípicos. Saltos também fornece uma nova abordagem para a análise de genes de efeito materno, que são refratários à análise fenotípica de0 F seguindo CRISPR/Cas9 mutagênese. Este manuscrito detalha o método dos saltos, com especial ênfase em como executar com sucesso o transplante de PGC.
Introdução
Como genótipo codifica o fenótipo tem sido uma grande questão em biologia desde a redescoberta de leis de Mendel. Uma compreensão das funções dos genes, sua regulação e interações nas redes do gene e as funções das promessas de produtos codificado para fornecer ferramentas para descobrir nova biologia e melhorar Estados de doença. Para mais de meio século1, a africana Xenopus, Xenopus, tem sido um líder modelo para estudos sobre uma grande variedade de tópicos em biologia básica e biomedicina, incluindo o controle genético do desenvolvimento. Historicamente, a maioria das pesquisas sobre Xenopus tem usado o sapo allotetraploid....
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Protocolo
Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso da Universidade da Califórnia, Irvine e institucional Cuidado Animal.
1. os preparativos para o transplante de PGC
- Prepare ferramentas de dissecação com antecedência, como descrito anteriormente,23.
Nota: Facas de sobrancelha cabelo são usadas para fazer incisões com o auxílio de um laço de cabelo para estabilizar o embrião durante a realização das cirurgias. Os pelos da sobrancelha e cabelo loops são colados no vidro de borosilicato pipetas Pasteur que ter sido desenhado pela primeira em uma chama e quebrados na porção diluída (ver
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Resultados
Após o transplante, a determinação qualitativa da eficácia de mutagénese CRISPR/Cas9 deve ser executada antes de despender o esforço na pecuária de crescer e manter os animais a maturidade sexual. Porque animais portadores leapfrog transplantes são somaticamente sua e do germline é difícil acesso para medições directas, salvar os cadáveres de embriões de dador torna-se importante. Análise de DNA de carcaças serve como um proxy para a extensão de mutagênese que ocorre no germline transplan.......
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Discussão
Este relatório fornece um protocolo detalhado para o transplante de tecido vegetal contendo PGCs. transplante de PGCs é usado em conjunto com tecnologias de edição de genoma (por exemplo, CRISPR/Cas9) para modificar o germline de um animal enquanto mantendo a quase todos os tecidos somáticos como geneticamente tipo selvagem. Para saltos para ser bem sucedido, há um número de fatores críticos a considerar antes de realizar a execução de transplantes.
Para garantir a completa substituiç.......
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Divulgações
O autor não tem nada para divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi realizado com o apoio de uma subvenção, 5R21HD080684-02, do Instituto Nacional de saúde infantil e desenvolvimento humano. O autor deseja agradecer a Ken Cho para seu contínuo entusiasmo e apoio. O autor também gostaria de reconhecer Bruce Blumberg para uso da sua câmera, Rebekah Charney, para a leitura crítica do manuscrito e Sean McNamara e Marcin Wlizla o recurso de Xenopus nacional (RRID:SCR_013731), para o valioso conversas sobre X. tropicalis alimentar e regimes de cuidados com animais.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Pinça Dumont #5 | Ferramentas de Ciência Fina | 11252-20 ou 11252-30 | |
| Faca | para | ||
| Caseiro Loop | Pipetas | ||
| caseiras de Pasteur, vidro borossilicato | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Krazy Glue (à base de cianoacrilato) | Elmer's Products, Inc. | KG581 | Para fixar pêlos de sobrancelha e alças de cabelo em pipetas Pasteur, outras colas semelhantes podem ser usadas. |
| Oligodesoxinucleotídeos, ordenados sob medida | Tecnologias de DNA integradas | Oligos de modelo personalizados para síntese de sgRNA, consulte Nakayama et al., 2014 para detalhes do projeto. | |
| Kit Megascript T7 | Ambion/ThermoFisher | AM1334 | Ou use o kit Megashortscript T7 (AM1354) |
| Fenol, Tris tamponado | Fenol destilado de alta qualidade de qualquer fornecedor comercial | ||
| Clorofórmio | Clorofórmio de alta qualidade de qualquer fornecedor comercial | ||
| Etanol | Etanol de alta qualidade de qualquer fornecedor comercial | ||
| Dietilpirocarbonato (DEPC) | Sigma Chemical Co. | Proteína D5758-50ML | |
| Cas9, com sinal de localização nuclear | PNA Bio, Inc. | CP01 | Reconstituído com água tratada com DEPC de acordo com as recomendações do fabricante |
| Solução de Ringers | Caseira. A receita (ref 26) para 1X MMR (sem EDTA) é 100mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES. A solução é ajustada em pH para 7,4. | ||
| Agarose | Qualquer agarose de grau de Biologia Molecular é suficiente | ||
| 60 placas de Petri X15 mm | Falcon | 351007 | |
| placas de 24 poços | Falcon | 3047 | |
| L-Cisteína | Sigma Chemical Co. | C7352-100G | Base livre, não sal HCl |
| Proteinase K Roche | 03 115 828 001 | Normalmente ~20mg/ml de Roche | |
| sera Micron | sera | Alimento para girinos. Ressuspender em meio de crescimento. Pode ser comprado em uma variedade de varejistas on-line |
Referências
- Gurdon, J. B., Hopwood, N. The introduction of Xenopus laevis into developmental biology: of empire, pregnancy testing and ribosomal genes. Int J Dev Biol. 44 (1), 43-50 (2000).
- Hellsten, U., et al. The genome of the Western clawed frog Xen....
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Reimpressões e permissões
