Trapianto di cellule germinali primordiali per basati su CRISPR/Cas9 rincorsa in Xenopus
Summary
Geni essenziali per la sopravvivenza pongono ostacoli tecnici per la creazione di linee mutanti. Rincorsa aggira la letalità combinando genoma editing con trapianto di cellule germinali primordiali per creare animali portatori di mutazioni di germline. Rincorsa consente anche la generazione efficiente di omozigoti mutanti nella generazione1 F. Qui, il passo di trapianto è dimostrato.
Abstract
La creazione di linee mutanti di editing genomico sta accelerando l’analisi genetica in molti organismi. Metodi CRISPR/Cas9 sono stati adattati per uso in Rana artigliata africana, Xenopus, un organismo di modello di vecchia data per la ricerca biomedica. Sistemi di allevamento tradizionali per la creazione di linee mutanti omozigoti con mutagenesi CRISPR/Cas9-mirate hanno diversi passaggi che richiede tempo e laboriosi. Per facilitare la creazione di embrioni mutanti, in particolare per superare gli ostacoli associati buttando giù geni che sono essenziali per l’embriogenesi, è stato sviluppato un nuovo metodo chiamato rincorsa. Questa tecnica sfrutta la robustezza degli embrioni di Xenopus di “taglia e incolla” Metodi embriologiche. Rincorsa utilizza il trasferimento di cellule primordiali germinali (PGC) da embrioni donati mutagenizzato efficientemente in fratelli germani PGC-ablazione wildtype. Questo metodo permette l’efficiente mutazione di geni essenziali creando animali chimerici con cellule somatiche wildtype che trasportano una mutante di germline. Quando due animali di0 F che trasportano “leapfrog trapianti” (cioè, mutante cellule germinali) sono incrociate, producono composti o omozigoti, eterozigoti, null F1 embrioni, risparmiando così un tempo di generazione completo per ottenere dati fenotipici. Rincorsa fornisce anche un nuovo approccio per l’analisi dei geni di effetto materno, che sono refrattari ad analisi fenotipica di F0 dopo mutagenesi CRISPR/Cas9. Questo manoscritto descrive in dettaglio il metodo di rincorsa, con speciale enfasi su come effettuare con successo il trapianto di PGC.
Introduction
Come genotipo Codifichi il fenotipo è stata una domanda importante nella biologia dato che la riscoperta delle leggi di Mendel. Una comprensione dei ruoli dei geni, la loro regolazione e interazioni all’interno di reti geniche e le funzioni delle promesse di prodotti codificati per fornire strumenti per scoprire nuova biologia e miglioramento degli Stati di malattia. Per oltre mezzo secolo1, la Rana artigliata africana, Xenopus, è stato un modello di punta per gli studi su una vasta gamma di argomenti in biologia di base e la biomedicina, compreso il controllo genetico dello sviluppo. Storicamente, la maggior parte della ricerca su Xenopus ha utilizzato la rana allotetraploide, X. laevis, ma più recentemente, a causa della sua diploidia, X. tropicalis è stato sviluppato come un modello genetico di anfibio. Sequenze di genoma completo sono stati assemblati da entrambi Xenopus specie2,3. La “comunità di rana” è ora a un punto di svolta dove tecnologia modifica base genoma permette lo studio della funzione genica, praticamente a volontà. Programmabile CRISPR/Cas9 endonucleasi hanno reso la mutagenesi di geni altamente efficiente, con mutazione biallelica possibile nella maggior parte delle cellule di animali4,5,6,7, 8,9,10,11. Questi studi, sottolineati dalla Bhattacharya et al. 12 e Shigeta et al. 13, hanno dimostrato che la funzione di molti geni possa essere studiata mediante mutagenesi in animali di mosaico0 F. Questo approccio ha molti vantaggi; Tuttavia, gli embrioni Cas9-sgRNA-microiniettati visualizzano spesso fenotipi variabili a causa di incompleta perdita di funzione (LOF). Più significativamente, la generazione di linee mutanti è estremamente vantaggiosa per alcune applicazioni — in particolare quando lo studio di geni che hanno un contributo di mRNA materno. Materna mRNA e proteine e le loro influenze su epigenetica, persistono per un periodo prolungato nell’embriogenesi14,15,16, rendendo i primi contributi inerenti allo sviluppo di molti geni refrattario alle analisi0 F. Pertanto, sono necessari altri approcci LOF.
Quando si cerca di creare linee mutanti, il percorso per ottenere embrioni LOF omozigotici ha diversi ostacoli. Mutagenesi in primo luogo, efficiente per produrre mutazioni bialleliche può essere svantaggiosa perché perdita delle funzioni dei geni essenziali esito negativo per sopravvivere alla maturità sessuale, interferendo con la produzione di una linea vitale. Una soluzione comune è la titolazione attenta della quantità di Cas9-sgRNA consegnato. Qui, l’obiettivo è raggiungere un equilibrio tra la riduzione di mortalità anche massimizzando l’efficienza di mutagenesi di germline. Un secondo problema nasce dallo schema standard di allevamento, dove analisi fenotipiche vengono posticipate fino alla generazione2 F. Utilizzando l’approccio standard, sessualmente maturi animali0 F che trasmettono mutante alleli attraverso la linea germinale sono esogamico per produrre F1 “eterozigoti”, che poi sono cresciute alla maturità sessuale. Due heterozygotes di1 F sono poi incrociate per produrre embrioni mutanti di F2 a una frequenza di Mendelian prevista del 25%. Due generazioni di allevamento sono quindi necessari per l’analisi dei fenotipi mutanti. Animali mutanti potrebbero essere omozigoti o eterozigoti composti (cioè, progenie contenente due alleli differenti del mutante, che dipende i genotipi di animali parentali utilizzati per il re di1 F).
Questi ostacoli possono essere superati da confinare programmabile mutagenesi nucleasi-mediata delle cellule di germe, che è alla base di un nuovo metodo denominato rincorsa17. Rincorsa ha due componenti principali: (1) la microiniezione di mRNA Cas insieme sgRNA o nucleasi-sgRNA complessi (o, in linea di principio, TALENs o zinco nucleasi a dita) allo stadio unicellulare da mutagenizzare efficientemente genoma embrionale, seguito da (2) il trapianto di PGC negli embrioni di pari livello wildtype, dove sono stati rimossi il PGC endogeno. Quando entrambi i passaggi sono la sostituzione di germline efficiente, completo con le cellule germinali mutante può essere ottenuta. Blackler dimostrata nei primi anni 1960 che Xenopus PGC potrebbe essere trapiantati tra embrioni alla neurula ritardato e presto tailbud fasi18,19. Per salto, approccio di Blackler modifica eseguendo i trapianti blastula fase17, quando PGC sono localizzati nel palo vegetal del embrione20,21. Il trapianto prima gastrulazione ha due vantaggi principali. In primo luogo, l’attecchimento di trapianti e il successivo sviluppo normale è stato trovato per essere più efficiente quando il trapianto viene effettuato nella fase di blastula (osservazioni non pubblicate). In secondo luogo, eseguendo trapianti blastula-fase poco dopo trascrizione zygotic è iniziata, si può evitare la letalità derivanti dal gene inerente allo sviluppo mutazioni che interrompono la gastrulazione o che altrimenti portano a neurulae fine non valido. PGC trapianto-cuscinetto (“scavalcati”) gli embrioni sono cresciuti alla maturità sessuale, e intercrosses tra questi animali0 F hanno dimostrato che, in molti casi, il 100% della prole F1 Visualizza il fenotipo LOF (la maggior parte essendo composto eterozigoti), che indica di germline completa sostituzione con le mutazioni mirate.
Si prevede che la rincorsa accelererà approcci genetici in Xenopus. Anche scavalcando fornisce un’alternativa al metodo “ospitare trasferimento”22 per l’analisi LOF di geni effetto materno (osservazioni non pubblicate). Nella pubblicazione corrente, una descrizione dettagliata del metodo, concentrandosi soprattutto sul trapianto di PGC, è presentata in X. tropicalis (con modifiche minori per X. laevis). Il trapianto di PGC è dimostrato qui per facilitare un più rapido trasferimento di questa tecnologia ad altri laboratori lavorando con Xenopus. I principi di questo metodo dovrebbero essere successo in altri anfibi (ad es., urodeli), e le modifiche di organismo-specific nella metodologia dovrebbero consentire per applicazione a molti altri animali in cui è possibile mutagenesi efficiente e PGC sono prontamente transplantable.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo rapporto fornisce un protocollo dettagliato per il trapianto del tessuto vegetale contenente PGC. trapianto di PGC viene utilizzato in combinazione con tecnologie di editing genomico (ad es., CRISPR/Cas9) per modificare la linea germinale di un animale mentre mantenendo quasi tutti i suoi tessuti somatici come geneticamente wild-type. Per la rincorsa per avere successo, ci sono un numero di fattori critici da considerare prima di eseguire trapianti performanti.
Per garantire la…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato effettuato con il supporto di una sovvenzione, 5R21HD080684-02, dal National Institute of Child Health and Human Development. L’autore desidera ringraziare Ken Cho per il suo continuo entusiasmo e sostegno. L’autore desidera inoltre ringraziare Bruce Blumberg per uso della sua macchina fotografica, Rebekah Charney, per la lettura critica del manoscritto e Sean McNamara e Marcin Wlizla presso la risorsa nazionale di Xenopus (RRID:SCR_013731), per le preziose conversazioni per quanto riguarda X. tropicalis alimentazione e regimi di cura degli animali.
Materials
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 or 11252-30 | |
| Eyebrow hair knife | Homemade | ||
| Hair loop | Homemade | ||
| Pasteur pipettes, borosilicate glass | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Krazy Glue (Cyanoacrylate-based) | Elmer's Products, Inc. | KG581 | To affix eyebrow hair and hair loops into Pasteur pipettes, other similar glues can be used. |
| Oligodeoxynucleotides, custom ordered | Integrated DNA Technologies | Custom ordered | Template oligos for sgRNA synthesis, see Nakayama et al., 2014 for design details. |
| Megascript T7 kit | Ambion/ThermoFisher | AM1334 | Or use Megashortscript T7 (AM1354) kit |
| Phenol, Tris buffered | High quality distilled phenol from any commercial supplier | ||
| Chloroform | High quality chloroform from any commercial supplier | ||
| Ethanol | High quality ethanol from any commercial supplier | ||
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma Chemical Co. | D5758-50ML | |
| Cas9 protein, with nuclear localization signal | PNA Bio, Inc. | CP01 | Reconstituted using DEPC-treated water according to manufacturer's recommendations |
| 10X Marc's Modified Ringers solution | Homemade. Recipe (ref 26) for 1X MMR (lacking EDTA) is 100mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES. Solution is pH adjusted to 7.4. | ||
| Agarose | Any Molecular Biology grade agarose is sufficient | ||
| 60 X15 mm Petri plates | Falcon | 351007 | |
| 24-well plates | Falcon | 3047 | |
| L-Cysteine | Sigma Chemical Co. | C7352-100G | Free base, not HCl salt |
| Proteinase K | Roche | 03 115 828 001 | Typically ~20mg/ml from Roche |
| sera Micron | sera | Tadpole food. Resuspend in growth medium. Can be purchased from a variety of online retailers |
Referências
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