Beoordeling van menselijk vetweefsel microvasculaire functie met behulp van Videomicroscopy
Summary
Videomicroscopy systemen worden gebruikt voor het onderzoeken van de functionele eigenschappen van geïsoleerde adipeus weefsel arteriolen in reactie op fysiologische en farmacologische stimuli. Deze techniek kan worden gebruikt om te onderzoeken microvasculaire fenotypen in verschillende adipeus weefsel domeinen bij zwaarlijvige mensen.
Abstract
Terwijl obesitas nauw met de ontwikkeling van metabole en cardiovasculaire ziekte verbonden is, is weinig bekend over de mechanismen die deze processen regelen. Het hypothetische is dat pro-atherogene bemiddelaars vrijgelaten uit vetweefsel met name in samenwerking met centrale/viscerale vetmobilisering pathogene vasculaire wijzigingen, zowel lokaal als systemisch bevorderen kunnen, en het begrip dat hart-en vaatziekten kan de gevolg van vetweefsel dysfunctie blijft zich ontwikkelen. Hier beschrijven we een unieke methode van videomicroscopy waarbij de analyse van vaatverwijdende en vasoconstrictor antwoorden van intact kleine menselijke arteriolen verwijderd uit de obesitas depot van levende menselijke proefpersonen. Videomicroscopy wordt gebruikt voor het onderzoeken van de functionele eigenschappen van geïsoleerde microvessels in reactie op farmacologische of fysiologische stimuli met behulp van een druk systeem dat in vivo voorwaarden bootst. De techniek is een nuttige benadering inzicht van de pathofysiologie en de moleculaire mechanismen die aan vasculaire dysfunctie lokaal binnen de kring van vetweefsel bijdragen. Afwijkingen in het adipeus weefsel microvasculature hebben bovendien ook verbonden met systemische ziekten. We deze techniek te onderzoeken depot-specifieke vasculaire reacties bij zwaarlijvige proefpersonen toegepast. We beoordeeld endotheel-afhankelijke vasodilatatie groeiende stroom én acetylcholine in obesitas arteriolen (50-350 µm inwendige diameter, 2-3 mm in lengte) geïsoleerd van twee verschillende obesitas depots tijdens bariatric chirurgie van dezelfde persoon. We toonden aan dat arteriolen van viscerale vet verminderde endotheel-afhankelijke vasodilatatie in vergelijking met de schepen van de subcutane depot geïsoleerd vertonen. De bevindingen suggereren dat de viscerale communicatie wordt geassocieerd met vasculaire endotheel disfunctie die relevant zijn voor de klinische observatie verhoogde viscerale vetmobilisering koppelen aan systemische ziekte mechanismen kan zijn. De videomicroscopy-techniek kan worden gebruikt om vasculaire fenotypes van verschillende vet depots onderzoeken evenals bevindingen van personen met verschillende mate van obesitas en metabole dysfunctie met elkaar vergelijken. De methode kan ook worden gebruikt om te onderzoeken vasculaire reacties overlangs in reactie op klinische interventies.
Introduction
Videomicroscopy is een handige techniek gebruikt om de vasomotorisch functie van kleine arteriolen verwijderd uit levende menselijke proefpersonen ex vivoonderzoeken. Ons laboratorium heeft zich gericht op ontrafeling uit kleine microvessels uit verschillende adipeus weefsel compartimenten te karakteriseren van de effecten van verschillende obesitas microenvironments op de microvasculature. Een groot voordeel van deze techniek is dat de bloedvaten van het menselijke lichaam verwijderd functioneren blijven en gemakkelijk binnen enkele minuten tot uren na biopsie kan worden onderzocht. Fysiologische omstandigheden worden geïmiteerd en stabiel Transmurale druk in de ruimte van de intraluminale via micro-glas-cannulas die veel in vivo kenmerken recapituleren gehandhaafd. 1 , 2 bovendien een betrouwbare videomicroscopy set-up met geautomatiseerde rand detectie software kunt voor zowel de kwantitatieve als de kwalitatieve beoordeling van endotheel-afhankelijke en -onafhankelijke vaatverwijdende en vasoconstrictor hoedanigheid van geïsoleerde schepen in real-time, executoriale snelle fysiologische beoordeling in reactie op fysieke en farmacologische stimuli. 3 andere microvasculaire technieken zijn ook beschikbaar, zoals draad myography die de neiging om minder tijd in beslag nemen en meten van spanning reacties op verschillende agonisten door een kracht transducer.
Ons laboratorium heeft videomicroscopy om zich te buigen over de relatie tussen obesitas en vasculaire dysfunctie, gericht op de effecten van verschillende adipeus weefsel domeinen op de therapieën worden toegepast. Centrale vetmobilisering met accumulatie van intra-abdominale visceraal vet is meest nauw gekoppeld aan adipocytokine productie, metabole dysfunctie en cardiometabolic risico. Het heeft zijn gepostuleerd dat adipeus weefsel dysfunctie met overproductie van pro-atherogene disregulatie van cytokines en adipokine zijn sterk betrokken bij deze processen, maar specifieke regelgevende moleculen en de behandeling doelstellingen grotendeels blijven onontdekt. 4 voorts, op het niveau van de lokale adipeus weefsel, de capillaire rarefaction en de verminderde perfusie zijn gekoppeld aan vetweefsel pseudohypoxia en metabole disregulatie. De hypothese dat hart-en vaatziekten mogelijk het gevolg van vetweefsel dysfunctie evolueert. Pro-atherogene bemiddelaars vrijgegeven uit vet, met name in samenwerking met centrale/viscerale vetmobilisering, waarschijnlijk bevorderen endotheel disfunctie en pathogene vasculaire veranderingen die kunnen manifesteren lokaal in de obesitas therapieën en gedetecteerd met behulp van de hierin beschreven methodologie. 5
De functionele beoordeling van geïsoleerde adipeus weefsel arteriolen is een nuttige benadering inzicht van de pathofysiologie en de moleculaire mechanismen die aan vasculaire dysfunctie in menselijke obesitas bijdragen. Voor het onderzoek naar de mechanismen die aan vet depot-specifieke dysfunctie bijdragen, hebben we methoden te onderzoeken endotheel-afhankelijke en – onafhankelijke vasodilatory reacties van de microvasculature, en evalueren van de expressie van verschillende regelgevende kandidaten in gepaarde viscerale en onderhuidse (SC) vetweefsel specimens verkregen zwaarlijvige onderwerpen ten tijde van bariatrische chirurgie.
Protocol
Representative Results
Discussion
De dissectie en de isolatie van obesitas arteriolen uit de omliggende weefsels kunnen een tijdrovend en arbeidsintensief proces met zorgvuldige aandacht voor detail en technisch protocol. De procedure microdissection vereist zorgvuldige vaardigheden en gespecialiseerde dissectie gebruiksvoorwerpen ter voorkoming van potentiële schade aan de gladde spieren of endothelial cel lagen van de microvasculature. Zelfs kleine toevallige lekke banden in de arteriolar muur kunnen voorkomen dat intraluminale overdruksystemen en res…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedank de vrijwilligers voor hun deelname aan deze studies en de chirurgische personeel op de Boston Medical Center voor het verstrekken van vetweefsel biopsieën. Dr. Gokce wordt ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) subsidies, HL081587, HL114675 en HL126141. Dr. Farb wordt ondersteund door de NIH K23 HL135394 verlenen.
Materials
| Chemical Name | |||
| Acetylcholine | Sigma Aldrich | A6625 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma Aldrich | 223506 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G5767 | |
| Endothelin-1 | Sigma Aldrich | E7764 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetra acetic acid (EGTA) | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | E9884 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3784 | |
| Nw-nito-L-arginine methyl ester hydrochloride | Sigma Aldrich | N5751 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma Aldrich | M7506 | |
| Potassium chloride (KCL) | Sigma Aldrich | P3911 | |
| Potassium phosphate (KH2PO4) | Sigma Aldrich | P5655 | |
| Papaverine | Sigma Aldrich | P3510 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3 ) | Sigma Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S7653 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2Po4) | Sigma Aldrich | S9638 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Forceps | Finescience tools | 15000-08 | |
| Inverted microscope | Zeiss Achromat | ||
| Laboratory tubing | Euro-Pharm | 250100306F999 | |
| Needle/pippette puller | David kopf instruments | 720 | |
| Ophthalmic monofilament nylon suture | Surgical specialties | A7756N | |
| Scissors | Finescience tools | 150000-08 | |
| Vessel Chamber | DMT | VAS v.2.1 |
Referências
- Schubert, R., Mulvany, M. J. The myogenic response: established facts and attractive hypotheses. Clin Sci (Lond). 96 (4), 313-326 (1999).
- Jadeja, R. N., Rachakonda, V., Bagi, Z., Khurana, S. Assessing Myogenic Response and Vasoactivity In Resistance Mesenteric Arteries Using Pressure Myography. J Vis Exp. (101), e50997 (2015).
- Gutterman, D. D., et al. The Human Microcirculation: Regulation of Flow and Beyond. Circ Res. 118 (1), 157-172 (2016).
- Fuster, J. J., Ouchi, N., Gokce, N., Walsh, K. Obesity-Induced Changes in Adipose Tissue Microenvironment and Their Impact on Cardiovascular Disease. Circ Res. 118 (11), 1786-1807 (2016).
- Farb, M. G., et al. Reduced adipose tissue inflammation represents an intermediate cardiometabolic phenotype in obesity. J Am Coll Cardiol. 58 (3), 232-237 (2011).
- Farb, M. G., et al. WNT5A-JNK regulation of vascular insulin resistance in human obesity. Vasc Med. 21 (6), 489-496 (2016).
- Durand, M. J., Phillips, S. A., Widlansky, M. E., Otterson, M. F., Gutterman, D. D. The vascular renin-angiotensin system contributes to blunted vasodilation induced by transient high pressure in human adipose microvessels. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 307 (1), H25-H32 (2014).
- Farb, M. G., et al. Cyclooxygenase inhibition improves endothelial vasomotor dysfunction of visceral adipose arterioles in human obesity. Obesity (Silver Spring). 22 (2), 349-355 (2014).
- Park, S. Y., et al. Impact of age on the vasodilatory function of human skeletal muscle feed arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 310 (2), H217-H225 (2016).
- Ives, S. J., et al. Human skeletal muscle feed arteries studied in vitro: the effect of temperature on alpha(1)-adrenergic responsiveness. Exp Physiol. 96 (9), 907-918 (2011).
- Grizelj, I., et al. Reduced flow-and acetylcholine-induced dilations in visceral compared to subcutaneous adipose arterioles in human morbid obesity. Microcirculation. 22 (1), 44-53 (2015).
- Farb, M. G., et al. Arteriolar function in visceral adipose tissue is impaired in human obesity. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (2), 467-473 (2012).
- Tanner, M. J., et al. Dynamin-Related Protein 1 Mediates Low Glucose-Induced Endothelial Dysfunction in Human Arterioles. Am J Physiol Heart Circ Physiol. , (2016).
- Ives, S. J., et al. alpha1-Adrenergic responsiveness in human skeletal muscle feed arteries: the impact of reducing extracellular pH. Exp Physiol. 98 (1), 256-267 (2013).
- Dharmashankar, K., et al. Nitric oxide synthase-dependent vasodilation of human subcutaneous arterioles correlates with noninvasive measurements of endothelial function. Am J Hypertens. 25 (5), 528-534 (2012).
- Truran, S., et al. Adipose and leptomeningeal arteriole endothelial dysfunction induced by beta-amyloid peptide: a practical human model to study Alzheimer’s disease vasculopathy. J Neurosci Methods. 235, 123-129 (2014).
- Karki, S., et al. Forkhead box O-1 modulation improves endothelial insulin resistance in human obesity. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (6), 1498-1506 (2015).
- Shahid, M., Buys, E. S. Assessing murine resistance artery function using pressure myography. J Vis Exp. (76), (2013).
