Die Aorta Ring Kokultur Assay: Ein komfortables Werkzeug, um angiogenen Potenzial des mesenchymaler Stromazellen Zellen In Vitro zu bewerten
Summary
Hier präsentieren wir eine neuartige Anwendung der Aorta Ring-Test, wo sind prelabelled mesenchymale Zellen Co kultiviert mit Ratte Aorta abgeleitet endotheliale Netzwerke. Diese neuartige Methode ermöglicht die Visualisierung von mesenchymaler Stromazellen Zellen (MSCs) Homing und Integration mit endothelialen Netzwerken, Quantifizierung der Netzwerkeigenschaften und Auswertung von MSC Immunophenotypes und gen-Expression.
Abstract
Angiogenese ist ein komplexen, stark regulierten Prozess verantwortlich für die Bereitstellung und Aufrechterhaltung angemessener Gewebedurchblutung. Unzureichende Gefäßsystem Wartungs- und pathologischen Fehlbildungen führt zu schweren ischämischen Erkrankungen, während allzu reichlich vaskulären Entwicklung mit Krebs und entzündliche Erkrankungen verbunden ist. Eine viel versprechende Form der Pro-angiogenen Therapie ist die Verwendung von angiogenen Zellen Quellen, die regulatorische Faktoren sowie körperliche Unterstützung für neu entstehender Gefäßsystem bilden können.
Mesenchymaler Stromazellen Zellen (MSCs) sind ausführlich untersuchten Kandidaten für vaskuläre Regeneration durch ihre parakrine Effekte und ihre Fähigkeit zu erkennen und Heimat von ischämischen oder entzündeten Gewebe. Insbesondere sind erste Trimester menschlichen Nabelschnur perivaskuläre Zellen (FTM HUCPVCs) einen vielversprechenden Kandidaten aufgrund ihrer Pericyte Eigenschaften, hohe proliferative und multilineage Potenzial, immun-privilegierten Eigenschaften und robuste parakrine Profil. Um effektiv potenziell angiogenen regenerativen Zellen bewerten, ist es eine Voraussetzung, sie zuverlässig und “übersetzbar” prä-klinischen Tests zu testen. Die Aorten Ring-Assay ist ein ex-Vivo Angiogenese Modell, die für einfache Quantifizierung von röhrenförmigen endothelial Strukturen ermöglicht, bietet Zubehör unterstützende Zellen und extrazellulären Matrix (ECM) vom Host schließt entzündliche Komponenten und ist schnell und kostengünstig einzurichten. Dies ist vorteilhaft im Vergleich zu in-Vivo -Modelle (z.B.Hornhaut-Assay, Matrigel Stecker Assay); die Aorta Ring-Assay kann verfolgen die verabreichten Zellen und beobachten Sie interzelluläre Wechselwirkungen Xeno-Immune Ablehnung zu vermeiden.
Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll für eine neuartige Anwendung des Aorten-Ring Assays, schließt menschliche MSCs in Ko-Kulturen mit entwickelnden Ratte Aorta endotheliale Netzwerke. Dieser Test ermöglicht die Analyse des MSC Beitrags zur Entstehung und Entwicklung durch physikalische Pericyte-ähnlichen Interaktionen Rohr und ihre Wirksamkeit für die Migration aktiv auf Seiten der Angiogenese und zur Beurteilung ihrer Fähigkeit führen und vermitteln ECM-Verarbeitung. Dieses Protokoll bietet weitere Informationen über Veränderungen im MSC-Phänotyp und gen-Ausdruck folgt Kokultur.
Introduction
Der komplexe Prozess der Angiogenese verbessert und Gewebedurchblutung durch die Förderung von Nachwuchs Schiff Entwicklung von bereits bestehenden Gefäßsystem1unterhält. Es ist ein streng regulierte, ausgewogene Prozess durch Pro-angiogenen und Anti-angiogenen Faktoren. Jeder Mangel in diesem System führen zu unzureichender Schiff Wartung oder Wachstum, verursacht schwere ischämische Erkrankungen wie Herzinfarkt Krankheit, Schlaganfall und Neurodegenerative Erkrankungen. Übertriebene vaskulären Entwicklung ist jedoch charakteristisch für Bedingungen wie Krebs und entzündliche Erkrankungen2.
Entwicklung von Therapien, die darauf abzielen, Angiogenese zu günstigen Geweberegeneration zu kontrollieren ist von zentraler Bedeutung. Trotz umfangreichen präklinischen und klinischen Untersuchungen haben Versuche mit Pro-angiogenen Faktoren und Micro-RNAs Angiogenese stimulieren konnte gewünschten Ergebnisse3,4,5zu erreichen. Mögliche Gründe für die vorübergehende Effekte sind: begrenzte Lebensdauer der angiogenen Proteine und Nukleinsäuren und die begrenzte Anzahl von gezielten Wachstumsfaktoren6,7. Obwohl lösliche angiogenen Faktoren entscheidend für die Initiierung der Angiogenese sind, hängen die Wartung und die Funktionalität des Gefäßsystems Zelltypen, einschließlich Perizyten und glatten Muskel Zellen8zu unterstützen. Bereich der Pro-angiogenen Therapien erforscht jetzt potenzielle Stammzellen und Vorläuferzellen Zelle, die angiogenen Faktoren vor Ort zur Verfügung stellen kann, während Gefäßsystem, selbst erneuern oder sogar Differenzierung in physisch unterstützt neu entwickelt werden. Endothel-wie Zellen9,10. Suche nach der optimalen angiogenen Zelltypen mit der Fähigkeit, diese funktionalen Anforderungen zu erfüllen verspricht für ischämische Geweberegeneration.
Um mögliche zellbasierte Therapien erfolgreich in klinischen Studien zu übersetzen, müssen prä-klinischen Studien ihre Wirksamkeit zu demonstrieren, und markieren Sie die zugrunde liegenden Mechanismen der Angiogenese. Trotz der hohen Anzahl von etablierten Angiogenese Assays, Bereich fehlt einen “Gold-Standard” in-vitro- Assay, die zuverlässig die Wirksamkeit von potenziellen Kandidaten Zelle Arten11,12, auswerten konnte 13. die meisten in-vitro- Angiogenese-Assays (einschließlich die endotheliale Proliferation, Migration und Rohr-Bildung-Assays) in der Regel bewerten die Auswirkungen von Zellen oder Verbindungen auf endothelialer Zellen phänotypischen Veränderungen oder Differenzierung in Stahlrohr und Netzwerk-Strukturen14,15. Während diese Funktionen für Angiogenese von entscheidender Bedeutung sind, sollte ein “übersetzbar” Assay auch bewerten: 1) die Augmentation oder den Austausch der unterstützende Zelltypen, einschließlich Perizyten oder glatten Muskelzellen, (2) die Verarbeitung von ECM und/oder Basalmembran, und 3). die Effizienz, die Bildung von funktionalen Microvasculature zu fördern. In Vivo Angiogenese Modelle, einschließlich der Hornhaut Assay und Matrigel Stecker Assay, rekapitulieren die einzigartige in Vivo Mikroumgebung, sondern stehen vor der Herausforderung durch die Schwierigkeiten bei der Verfolgung verabreicht Zellen, physikalische Wechselwirkungen zu beobachten. Darüber hinaus kann in in Vivo Modellen Xeno-Immune Ablehnung auftreten, während des Tests mögliche allogene Zelle Therapie Kandidaten16. Ex Vivo Angiogenese-Modelle kann besonders die Aorta Ring-Assay zur Verfügung stellen: (1) einfache Beobachtung und Quantifizierung der röhrenförmigen Strukturen, (2) Zubehör unterstützende Zellen (3) ECM von Host und künstliche Zubehör (4) Ausschluss von entzündlichen Komponenten, und 5) schnelle und kostengünstige Installation17,18. In der Regel kann die Aorta Ring-Assay angiogenen Potenzial der kleine Sekretorische Proteine, pharmakologische Wirkstoffe und transgene Nager-Modelle19,20,21testen.
MSCs sind viel versprechende Kandidaten für vaskuläre Regeneration in erster Linie durch ihre parakrine-vermittelten Effekte22,23,24. MSCs haben gezeigt, dass wichtige angiogenen Faktoren wie Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), Hepatozyten-Wachstumsfaktor (HGF), sezernieren Insulin-Like Growth Factor-1 (IGF-1), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) und Angiopoeitin-1 (Ang-1)25 ,26. MSCs können auch erkennen und Heimat von ischämischen oder entzündeten Gewebe, jedoch die genauen Mechanismen sind derzeit noch untersucht. In zunehmendem Maße unterstützt die Literatur die Hypothese, dass die meisten MSCs perivaskuläre Zellen entstehen, Co Pericyte Marker Express und können Verhalten sich wie Perizyten27. HUCPVCs sind eine junge MSCs abgeleitet aus der perivaskuläre Region der menschlichen Nabelschnur. Sie repräsentieren eine Bevölkerung von MSCs mit Pericyte-Like Eigenschaften und wurden von FTM und Begriff Nabelschnüre charakterisiert. FTM HUCPVCs zeigen eine hohe Expression von Pericyte Markern einschließlich CD146 und NG2, hohe proliferative und multilineage Potenzial, immun-privilegierten Eigenschaften und zeigt eine robuste parakrine Profil28. FTM HUCPVCs sind ein idealer Kandidat Zelltyp, Regeneration des verletzten Gewebes durch die Förderung von neuen Gefäßsystem über ihre Pericyte-ähnliche Eigenschaften zu fördern.
Um die angiogenen Potenzial und Pericyte-ähnliche Eigenschaften der menschlichen MSCs zu testen, sind eine sehr begrenzte Anzahl von Angiogenese-Assays zur Verfügung wo positive Angiotropic Migration (nachfolgend “Homing”), ECM Bearbeitung und Entwicklung von körperlichen Wechselwirkungen zwischen Zelltypen können untersucht werden, während quantitative Daten über Microvasculature Entwicklung zu erhalten.
Hiermit präsentieren wir eine Protokoll, die eine neuartige Anwendung der Aorta Ring-Test beschreibt. Menschlichen MSCs waren Co kultiviert mit entwickelnden Ratte abgeleitet Aorten endotheliale Netzwerken, um ihren Beitrag zur Entstehung, Reifung und Homöostase Rohr zu beurteilen. Diese Version von der Aorta Ring-Test bewertet die Fähigkeit und Potenz der Zelle Therapie Kandidaten nach Hause führen Sie zu Seiten der Angiogenese, ECM Verarbeitung vermitteln und tragen zur endothelialen röhrenförmigen Entwicklung durch den Aufbau von Pericyte-wie körperliche Interaktionen. Neben der Quantifizierung des Nettoeffekt von MSCs auf in-vitro- endothelialen Netzwerkbildung und interzelluläre Wechselwirkungen zu beobachten, haben wir auch ein Protokoll zur MSCs von Ko-Kulturen zu isolieren optimiert. Durch Durchflusszytometrie und qPCR, ist es möglich, Veränderungen in MSC Phänotyp und gen-Expression nach Kokultur zu charakterisieren. Als Modell Zelltypen verglichen wir ontogenetisch früh (pränatal) und Ende (Erwachsenen-) Quellen des menschlichen MSCs: FTM HUCPVCs und menschlichen Knochenmark stammenden MSCs (BMSC), bzw. in die Aorta Ring-Assay. Wir schlagen vor, der Aorta Ring-Test verwendet werden, um das angiogenen Potenzial der jeden physisch unterstützende Zelltyp beim untersuchten angiogenen regenerative Anwendungen zu studieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es gibt mehrere kritische Phasen beim Aufbau eines erfolgreichen Aorten Ring Assays MSC Kokultur Experiment. Erstens sind die wichtigsten Schritte beim isolieren und Aorta-Schnitt: 1) erhalten ausschließlich die thorakale Segment der Aorta; (2) vorsichtig entfernen, verzweigten Blutgefäße, Bindegewebe und Fettgewebe und; (3) schneiden sogar Abschnitte der Aorta (~ 1 mm), Variabilität zwischen einzelnen Assay zu begrenzen. Zweitens ist die erfolgreiche Einbettung der Aorta Ringe in BME für dieses Tests von entscheide…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken den folgenden Mitarbeiter und Personal Forschung: Andrée Gauthier-Fisher, Matthew Librach, Tanya Barretto, Tharsan Velauthapillai und Sarah Laronde.
Materials
| Alpha-MEM | Gibco | 12571071 | For FTM HUCPVC and BMSC culture media. |
| APC-conjugated anti human TRA-1-85 | R&D Systems | FAB3195A | Human-specific cell marker for flow cytometry and cell sorting |
| Basal membrane extract (BME) (Matrigel) | Corning | 354234 | For aorta embedding |
| Bullet-kit | Lonza | CC-3162 | Includes: Gentamicin/Amphotericin-B (GA)human Epidermal Growth Factor (hEGF); Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF); R3- Insulin-like Growth Factor-1 (R3-IGF-1); Ascorbic Acid; Hydrocortisone; human Fibroblast Growth Factor-Beta (hFGF-β); Heparin; Fetal Bovine Serum (FBS). Required to prepare EGM |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Thermo-fisher | C2925 | For staining MSCs, green is picked up optimally by MSCs |
| CKX53 Culture Microscope | Olympus | For bright-field imaging of endothelial network development | |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | C10227 | Cell counting for MSC culture, flow cytometry and qPCR |
| Dispase | StemCell technologies | 7923 | For dissociating aortic ring-MSC co-cultures (pre-warm at 37 °C) |
| Disposable sterile scalpels | VWR | 21909-654 | For sectioning aorta |
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D8537 | PBS. 1X, Without calcium chloride and magnesium chloride |
| Endothelial basal media (EBM) | Lonza | CC-3156 | Basal media required for culturing aortic ring assay-MSC co-cultures (warm at 37 °C before use). Required for EGM and EBM-FBS |
| Ethanol, 70%, Biotechnology Grade | VWR | 97064-768 | To sterilize surfaces |
| EVOS | Life Technologies | In-house fluorescent microscope to track MSC migration and integration | |
| Fetal bovine serum (FBS) (Hyclone) | GE Healthcare | SH3039603 | Serum component of cell culture medium |
| FITC-conjugated anti-CD31 antibody | BD | 558068 | Human endothelial marker for flow cytometry |
| FITC-conjugated anti-CD146antibody | BD | 560846 | Human pericyte marker for flow cytometry |
| Forceps | Almedic | 7727-A10-704 | For handing rat tissue. Can use any similar forceps |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14175-094 | 1X Without calcium chloride and magnesium chloride |
| HERAcell 150i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 51026410 | For incubating cells |
| Human Angiogenesis RT2 profiler PCR array | Qiagen | PAHS-024Z | Human specific and includes primers for 84 genes involved in angiogenesis. Each well is 1 primer reaction |
| ImageJ | Open source image processing software. Require Angiogenesis analyzer plugin | ||
| LSR II | BD | UHN SickKids FC Facility. For flow cytometry. | |
| MoFlo Astrios | Beckman Coulter | UHN SickKids FC Facility. For cell sorting. | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140122 | Antibiotic component to buffers and cell culture medium |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | For RNA purification. Includes cell lysis buffer |
| RT2Easy First Strand Kit | Qiagen | 330421 | For preparation of cDNA for qPCR |
| RT2PreAMP cDNA Synthesis Kit | Qiagen | 330451 | Pre-amplification of cDNA if low-yield RNA |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | For cutting skin, muscle and aorta |
| Sterile gauze | VWR | 3084 | To dampen and sterilize chest fur |
| TrypleE | Thermo Fisher Scientific | 12605036 | MSC dissociation enzyme pre-warm at 37 °C |
| 0.2 μm pore filtration unit | Thermo Fisher Scientific | 566-0020 | To sterilize tissue culture media |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200056 | For cell dissociation, pre-warm at 37 °C |
| 10 cm tissue culture dishes | Corning | 25382-428 | For cleaning and sectioning aorta and MSC cell culture |
| 12 well-cell culture plates | Corning-Sigma Aldrich | CLS3513 | For setting up aortic ring assay-MSC co-cultures |
| 15 mL tube | BD Falcon | 352096 | For general tissue culture procedures |
| 70 μm cell strainer | Fisherbrand | 22363548 | To ensure a single cell suspension before flow cytometry or sorting |
Referências
- Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146 (6), 873-887 (2011).
- Hoeben, A., Landuyt, B., Highley, M. S., Wildiers, H., Van Oosterom, A. T., De Bruijn, E. A. Vascular endothelial growth factor and angiogenesis. Pharmacol Rev. 56 (4), 549-580 (2004).
- Khan, T. A., Sellke, F. W., Laham, R. J. Gene therapy progress and prospects: therapeutic angiogenesis for limb and myocardial ischemia. Gene Ther. 10 (4), 285-291 (2003).
- Gupta, R., Tongers, J., Losordo, D. W. Human studies of angiogenic gene therapy. Circ Res. 105 (8), 724-736 (2009).
- Chu, H., Wang, Y. Therapeutic angiogenesis: controlled delivery of angiogenic factors. Ther Deliv. 3 (6), 693-714 (2012).
- Cao, Y. Therapeutic angiogenesis for ischemic disorders: what is missing for clinical benefits?. Discov Med. 9 (46), 179-184 (2010).
- Said, S. S., Pickering, J. G., Mequanint, K. Advances in growth factor delivery for therapeutic angiogenesis. J Vasc Res. 50 (1), 35-35 (2013).
- Bergers, G., Song, S. The role of pericytes in blood-vessel formation and maintenance. Neuro Oncol. 7 (4), 452-464 (2005).
- Leeper, N. J., Hunter, A. L., Cooke, J. P. Stem cell therapy for vascular regeneration: adult, embryonic, and induced pluripotent stem cells. Circulation. 122 (5), 517-526 (2010).
- Sieveking, D. P., Ng, M. K. Cell therapies for therapeutic angiogenesis: back to the bench. Vasc Med. 14 (2), 153-166 (2009).
- Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int J Exp Pathol. 90 (3), 195-221 (2009).
- Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. Angiogenesis assays: a critical overview. Clin Chem. 49 (1), 32-40 (2003).
- Tahergorabi, Z., Khazaei, M. A review on angiogenesis and its assays. Iran J Basic Med Sci. 15 (6), 1110-1126 (2012).
- Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: state of the science and the art. Angiogenesis. 12 (3), 267-274 (2009).
- Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nat Protoc. 5 (4), 628-635 (2010).
- Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J Cell Mol Med. 10 (3), 588-612 (2006).
- Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis: a quarter century of search and discovery. J Cell Mol Med. 13 (10), 4113-4136 (2009).
- Baker, M., et al. Use of the mouse aortic ring assay to study angiogenesis. Nat Protoc. 7 (1), 89-104 (2011).
- Guo, J., et al. A secreted protein (Canopy 2, CNPY2) enhances angiogenesis and promotes smooth muscle cell migration and proliferation. Cardiovasc Res. 105 (3), 383-393 (2015).
- Wittig, C., Scheuer, C., Parakenings, J., Menger, M. D., Laschke, M. W. Geraniol Suppresses Angiogenesis by Downregulating Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)/VEGFR-2 Signaling. PLoS One. 10 (7), e0131946 (2015).
- Masson, V. V., et al. Mouse Aortic Ring Assay: A New Approach of the Molecular Genetics of Angiogenesis. Biol Proced Online. 4, 24-31 (2002).
- Caplan, A. I. Adult mesenchymal stem cells for tissue engineering versus regenerative medicine. J Cell Physiol. 213 (2), 341-347 (2007).
- Caplan, A. I., Dennis, J. E. Mesenchymal stem cells as trophic mediators. J Cell Biochem. 98 (5), 1076-1084 (2006).
- Keating, A. Mesenchymal stromal cells: new directions. Cell Stem Cell. 10 (6), 709-716 (2012).
- Kilroy, G. E., et al. Cytokine profile of human adipose-derived stem cells: expression of angiogenic, hematopoietic, and pro-inflammatory factors. J Cell Physiol. 212 (3), 702-709 (2007).
- Tang, Y. L., et al. Paracrine action enhances the effects of autologous mesenchymal stem cell transplantation on vascular regeneration in rat model of myocardial infarction. Ann Thorac Surg. 80 (1), 229-236 (2005).
- Caplan, A. I. All MSCs are pericytes?. Cell Stem Cell. 3 (3), 229-230 (2008).
- Hong, S. H., et al. Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation. Stem Cells Dev. 22 (17), 2425-2439 (2013).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: The ARRIVE guidelines for reporting animal research. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 94-99 (2010).
- Sarugaser, R., Ennis, J., Stanford, W. L., Davies, J. E. Isolation, propagation, and characterization of human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs). Methods Mol Biol. 482, 269-279 (2009).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Gelati, M., Aplin, A. C., Fogel, E., Smith, K. D., Nicosia, R. F. The angiogenic response of the aorta to injury and inflammatory cytokines requires macrophages. J Immunol. 181 (8), 5711-5719 (2008).
