El ensayo de co-cultivo del anillo aórtico: Una herramienta conveniente para evaluar el potencial angiogénico de las células mesenquimales estromales In Vitro
Summary
Aquí, presentamos un uso nuevo del ensayo de anillo aórtico donde prelabelled las células mesenquimales son cultivadas conjuntamente con redes endotelial derivado de aorta de rata. Este novedoso método permite la visualización de autoguiado hacia el blanco las células estromales mesenquimales (MSCs) y la integración con redes endoteliales, cuantificación de propiedades de red y la evaluación del MSC immunophenotypes y expresión genética.
Abstract
La angiogénesis es un proceso complejo y altamente regulado responsable de proveer y mantener la perfusión adecuada del tejido. Mantenimiento insuficiente de la vasculatura y malformaciones patológicas pueden resultar en graves enfermedades isquémicas, mientras que demasiado abundante desarrollo vascular está asociado con cáncer y enfermedades inflamatorias. Una forma prometedora de la terapia pro-angiogénica es el uso de fuentes de células angiogénicas, que puede proporcionar factores reguladores, así como soporte físico para el desarrollo de nueva vasculatura.
Células estromales mesenquimales (MSCs) son candidatos extensivamente investigados para la regeneración vascular debido a sus efectos paracrinos y su capacidad para detectar y hogar de los tejidos isquémicos o inflamados. En particular, primer trimestre células perivascularias de cordón umbilical humano (FTM HUCPVCs) están un candidato muy prometedor debido a su propiedades pericyte-como, alto potencial proliferativo y del multilineage, propiedades inmunes privilegiados y paracrina robusto Perfil. Evaluar con eficacia potencialmente células regenerativas angiogénica, es un requisito para probar en confiable y ensayos preclínicos “traducible”. El ensayo del anillo aórtico es un modelo ex vivo angiogénesis que permite fácil cuantificación de estructuras endoteliales tubulares, ofrece accesorios apoyo células y matriz extracelular (ECM) del anfitrión, excluye componentes inflamatorios y es rápido y barato configurar. Esto es ventajoso en comparación con modelos en vivo (p. ej., análisis de córnea, Matrigel enchufe de ensayo); el ensayo de anillo aórtico puede seguir las células administradas y observar las interacciones intercelulares evitando xeno inmune rechazo.
Presentamos un protocolo para un uso nuevo de la prueba del anillo aórtico, que incluye MSCs humanos en co-cultivos con redes endotelial aórtica de la rata en desarrollo. Este análisis permite el análisis de la contribución de MSC para formación y desarrollo a través de interacciones físicas pericyte-como del tubo y de su potencia para activamente migrar a sitios de la angiogénesis y para evaluar su capacidad para realizar y mediar Procesamiento de ECM. Este protocolo proporciona más información sobre cambios en MSC fenotipo y expresión genética después de co-cultivo.
Introduction
El complejo proceso de la angiogénesis mejora y mantiene la perfusión del tejido de sangre nueva buque promoción de las preexistentes vasculatura1. Es un proceso estrechamente regulado y equilibrado por factores pro-angiogénicos y antiangiogénicos. Cualquier deficiencia en este sistema puede llevar a buque insuficiente mantenimiento o crecimiento, causando graves enfermedades isquémicas, incluyendo enfermedad miocardio, accidente cerebrovascular y trastornos neurodegenerativos. Sin embargo, el exagerado desarrollo vascular es característica para condiciones como cáncer y trastornos inflamatorios2.
Desarrollo de terapias que tienen como objetivo controlar la angiogénesis para lograr regeneración tisular favorable es de importancia clave. A pesar de extensas investigaciones preclínicas y clínicas, intentos para estimular la angiogénesis mediante microRNAs y factores pro-angiogénicos han fracasado para lograr los resultados deseados3,4,5. Posibles razones de los efectos transitorios incluyen: longevidad limitada de proteínas angiogénicas y ácidos nucleicos y el finito número de objetivo de6,de factores de crecimiento7. Aunque factores angiogénicos solubles son esenciales para iniciar la angiogénesis, el mantenimiento y la funcionalidad de vasculatura dependen de apoyo tipos de células incluyendo células de pericitos y músculo liso8. El campo de la favorable-angiogenic terapias ahora está explorando fuentes potenciales de células madre y progenitoras celulares que pueden proporcionar factores angiogénicos localmente, mientras que apoyar físicamente recién desarrollado vasculatura, uno mismo-renovar o incluso diferenciarse en las células endoteliales como9,10. Encontrar la óptima angiogénicos tipos celulares con la capacidad para cumplir con estos requisitos funcionales sostiene una gran promesa para la regeneración de tejido isquémico.
Con el fin de traducir con éxito terapias basadas en células potenciales en ensayos clínicos, los estudios preclínicos necesitan demostrar su eficacia y resaltar los mecanismos angiogénicos subyacentes. A pesar del alto número de ensayos de angiogénesis establecida, el campo carece de un análisis de “estándar de oro” en vitro que confiablemente podría evaluar la eficacia del potencial candidato célula tipos11,12, 13. mayoría en vitro angiogénesis ensayos (incluyendo los ensayos de formación endoteliales de proliferación, migración y tubo) por lo general evaluación los efectos de las células o compuestos en cambio fenotípico o diferenciación en células endoteliales tubulares y estructuras de red14,15. Mientras que estas características son esenciales para la angiogénesis, también debe de evaluar un ensayo “traducible”: 1) el aumento o reemplazo de los tipos celulares soporte incluyendo pericitos o células musculares lisas, 2) el proceso del ECM o la membrana del sótano, y 3). la eficiencia para promover la formación de microvascularización funcional. En vivo modelos de angiogénesis, incluyendo la córnea ensayo y ensayo de tapón de Matrigel, recapitulan el microambiente único en vivo pero se enfrentan con la dificultad de seguimiento administrado células para observar interacciones físicas. Además, en modelos en vivo , xeno inmune rechazo puede ocurrir durante la prueba de potencial de candidatos de terapia allogeneic de la célula16. Ex vivo modelos de angiogénesis, particularmente el ensayo del anillo aórtico puede proporcionar: 1) la fácil observación y cuantificación de estructuras tubulares, células de apoyo 2) accesorias, 3) ECM de acogida y de fuentes artificiales, 4) exclusión de inflamatoria componentes y 5) configuración rápida y barata17,18. Por lo general, el ensayo de anillo aórtico puede probar el potencial angiogénico de pequeñas proteínas secretoras, agentes farmacológicos y modelos de roedores transgénicos19,20,21.
MSCs son candidatos prometedores para la regeneración vascular principalmente a través de sus efectos paracrina mediada22,23,24. MSCs se ha demostrado que secretar factores angiogénicos clave como Factor de crecimiento endotelial Vascular (VEGF), Factor de crecimiento de hepatocito (HGF), Factor de crecimiento insulínico-1 (IGF-1), Factor de crecimiento fibroblástico (bFGF) básicos y angiopoeitin-1 (Ang-1)25 ,26. MSCs pueden también detectar y tejidos hogar de isquémico o inflamada, sin embargo, los mecanismos exactos son todavía objeto de investigación. Cada vez más, la literatura apoya la hipótesis de que MSCs mayoría surgen de células perivasculares, co expresan pericyte marcadores, pueden comportarse como del pericitos27. HUCPVCs son una fuente joven de MSCs derivada de la región perivascular del cordón umbilical humano. Representan una población de MSCs con pericyte-como las características y se han caracterizado de cordón umbilical FTM y término. HUCPVCs FTM demuestran una alta expresión de marcadores pericyte incluyendo propiedades de privilegio inmunitario CD146 y NG2, alto potencial proliferativo y del multilineage y mostrar un perfil robusto paracrina del28. HUCPVCs FTM son un tipo de célula del candidato ideal para promover la regeneración del tejido lesionado mediante la promoción de nueva vasculatura a través de sus propiedades pericyte-como.
Para probar el potencial angiogénico y pericyte-como propiedades de MSCs humanas, un número muy limitado de ensayos de angiogénesis es migración de angiotropic disponible donde positivo (en lo sucesivo denominado el “homing”), ECM procesamiento y desarrollo de la física interacciones entre tipos de células pueden investigarse, mientras que la obtención de datos cuantitativos en el desarrollo de la microvascularización.
Por este medio presentamos un protocolo que describe un uso nuevo del ensayo de anillo aórtico. MSCs humanos fueron cultivadas conjuntamente con redes endoteliales aórticas derivados de rata en desarrollo para evaluar su contribución a la formación, maduración y homeostasis del tubo. Esta versión del ensayo de anillo aórtico evalúa la capacidad y la potencia de los candidatos de terapia celular inicio a sitios de la angiogénesis, realizar median el procesamiento de ECM y contribuir al desarrollo tubular endotelial mediante el establecimiento de pericyte-como física interacciones. Además de cuantificar el efecto neto de MSCs en vitro formación red endotelial y la observación de las interacciones intercelulares, nosotros también optimizado un protocolo para aislar MSCs de co-cultivos. Mediante qPCR y citometría de flujo, es posible caracterizar cambios en MSC fenotipo y expresión genética después de co-cultivo. Como tipos de la célula del modelo, se compararon ontogeneticamente temprano (prenatal) y últimas fuentes (adultas) de MSCs humanos: mAh HUCPVCs y humanas derivadas de la médula ósea MSCs (CMMo), respectivamente, en el análisis del anillo aórtico. Proponemos que el ensayo de anillo aórtico puede utilizarse para estudiar el potencial angiogénico de cualquier tipo de célula física apoyo cuando bajo investigación para aplicaciones regenerativas angiogénicos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hay varias etapas críticas en la creación de un ensayo de anillo aórtico exitoso experimento de cocultivo MSC. En primer lugar, los pasos más importantes cuando aislar y seccionar la aorta son: 1) obtener exclusivamente el segmento torácico de la aorta; 2) con cuidado quitar la ramificación de los vasos sanguíneos, conjuntivo y tejido adiposo y; 3) cortar hasta secciones de la aorta (~ 1 mm) para limitar la variabilidad entre cada ensayo. En segundo lugar, la incorporación exitosa de anillos aórticos en BME es f…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecemos a los siguientes funcionarios y personal de investigación: Andrée Gauthier-Fisher, Matthew Librach, Tanya Barretto, Tharsan Velauthapillai y Sarah Laronde.
Materials
| Alpha-MEM | Gibco | 12571071 | For FTM HUCPVC and BMSC culture media. |
| APC-conjugated anti human TRA-1-85 | R&D Systems | FAB3195A | Human-specific cell marker for flow cytometry and cell sorting |
| Basal membrane extract (BME) (Matrigel) | Corning | 354234 | For aorta embedding |
| Bullet-kit | Lonza | CC-3162 | Includes: Gentamicin/Amphotericin-B (GA)human Epidermal Growth Factor (hEGF); Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF); R3- Insulin-like Growth Factor-1 (R3-IGF-1); Ascorbic Acid; Hydrocortisone; human Fibroblast Growth Factor-Beta (hFGF-β); Heparin; Fetal Bovine Serum (FBS). Required to prepare EGM |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Thermo-fisher | C2925 | For staining MSCs, green is picked up optimally by MSCs |
| CKX53 Culture Microscope | Olympus | For bright-field imaging of endothelial network development | |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | C10227 | Cell counting for MSC culture, flow cytometry and qPCR |
| Dispase | StemCell technologies | 7923 | For dissociating aortic ring-MSC co-cultures (pre-warm at 37 °C) |
| Disposable sterile scalpels | VWR | 21909-654 | For sectioning aorta |
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D8537 | PBS. 1X, Without calcium chloride and magnesium chloride |
| Endothelial basal media (EBM) | Lonza | CC-3156 | Basal media required for culturing aortic ring assay-MSC co-cultures (warm at 37 °C before use). Required for EGM and EBM-FBS |
| Ethanol, 70%, Biotechnology Grade | VWR | 97064-768 | To sterilize surfaces |
| EVOS | Life Technologies | In-house fluorescent microscope to track MSC migration and integration | |
| Fetal bovine serum (FBS) (Hyclone) | GE Healthcare | SH3039603 | Serum component of cell culture medium |
| FITC-conjugated anti-CD31 antibody | BD | 558068 | Human endothelial marker for flow cytometry |
| FITC-conjugated anti-CD146antibody | BD | 560846 | Human pericyte marker for flow cytometry |
| Forceps | Almedic | 7727-A10-704 | For handing rat tissue. Can use any similar forceps |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14175-094 | 1X Without calcium chloride and magnesium chloride |
| HERAcell 150i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 51026410 | For incubating cells |
| Human Angiogenesis RT2 profiler PCR array | Qiagen | PAHS-024Z | Human specific and includes primers for 84 genes involved in angiogenesis. Each well is 1 primer reaction |
| ImageJ | Open source image processing software. Require Angiogenesis analyzer plugin | ||
| LSR II | BD | UHN SickKids FC Facility. For flow cytometry. | |
| MoFlo Astrios | Beckman Coulter | UHN SickKids FC Facility. For cell sorting. | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140122 | Antibiotic component to buffers and cell culture medium |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | For RNA purification. Includes cell lysis buffer |
| RT2Easy First Strand Kit | Qiagen | 330421 | For preparation of cDNA for qPCR |
| RT2PreAMP cDNA Synthesis Kit | Qiagen | 330451 | Pre-amplification of cDNA if low-yield RNA |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | For cutting skin, muscle and aorta |
| Sterile gauze | VWR | 3084 | To dampen and sterilize chest fur |
| TrypleE | Thermo Fisher Scientific | 12605036 | MSC dissociation enzyme pre-warm at 37 °C |
| 0.2 μm pore filtration unit | Thermo Fisher Scientific | 566-0020 | To sterilize tissue culture media |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200056 | For cell dissociation, pre-warm at 37 °C |
| 10 cm tissue culture dishes | Corning | 25382-428 | For cleaning and sectioning aorta and MSC cell culture |
| 12 well-cell culture plates | Corning-Sigma Aldrich | CLS3513 | For setting up aortic ring assay-MSC co-cultures |
| 15 mL tube | BD Falcon | 352096 | For general tissue culture procedures |
| 70 μm cell strainer | Fisherbrand | 22363548 | To ensure a single cell suspension before flow cytometry or sorting |
Referências
- Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146 (6), 873-887 (2011).
- Hoeben, A., Landuyt, B., Highley, M. S., Wildiers, H., Van Oosterom, A. T., De Bruijn, E. A. Vascular endothelial growth factor and angiogenesis. Pharmacol Rev. 56 (4), 549-580 (2004).
- Khan, T. A., Sellke, F. W., Laham, R. J. Gene therapy progress and prospects: therapeutic angiogenesis for limb and myocardial ischemia. Gene Ther. 10 (4), 285-291 (2003).
- Gupta, R., Tongers, J., Losordo, D. W. Human studies of angiogenic gene therapy. Circ Res. 105 (8), 724-736 (2009).
- Chu, H., Wang, Y. Therapeutic angiogenesis: controlled delivery of angiogenic factors. Ther Deliv. 3 (6), 693-714 (2012).
- Cao, Y. Therapeutic angiogenesis for ischemic disorders: what is missing for clinical benefits?. Discov Med. 9 (46), 179-184 (2010).
- Said, S. S., Pickering, J. G., Mequanint, K. Advances in growth factor delivery for therapeutic angiogenesis. J Vasc Res. 50 (1), 35-35 (2013).
- Bergers, G., Song, S. The role of pericytes in blood-vessel formation and maintenance. Neuro Oncol. 7 (4), 452-464 (2005).
- Leeper, N. J., Hunter, A. L., Cooke, J. P. Stem cell therapy for vascular regeneration: adult, embryonic, and induced pluripotent stem cells. Circulation. 122 (5), 517-526 (2010).
- Sieveking, D. P., Ng, M. K. Cell therapies for therapeutic angiogenesis: back to the bench. Vasc Med. 14 (2), 153-166 (2009).
- Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int J Exp Pathol. 90 (3), 195-221 (2009).
- Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. Angiogenesis assays: a critical overview. Clin Chem. 49 (1), 32-40 (2003).
- Tahergorabi, Z., Khazaei, M. A review on angiogenesis and its assays. Iran J Basic Med Sci. 15 (6), 1110-1126 (2012).
- Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: state of the science and the art. Angiogenesis. 12 (3), 267-274 (2009).
- Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nat Protoc. 5 (4), 628-635 (2010).
- Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J Cell Mol Med. 10 (3), 588-612 (2006).
- Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis: a quarter century of search and discovery. J Cell Mol Med. 13 (10), 4113-4136 (2009).
- Baker, M., et al. Use of the mouse aortic ring assay to study angiogenesis. Nat Protoc. 7 (1), 89-104 (2011).
- Guo, J., et al. A secreted protein (Canopy 2, CNPY2) enhances angiogenesis and promotes smooth muscle cell migration and proliferation. Cardiovasc Res. 105 (3), 383-393 (2015).
- Wittig, C., Scheuer, C., Parakenings, J., Menger, M. D., Laschke, M. W. Geraniol Suppresses Angiogenesis by Downregulating Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)/VEGFR-2 Signaling. PLoS One. 10 (7), e0131946 (2015).
- Masson, V. V., et al. Mouse Aortic Ring Assay: A New Approach of the Molecular Genetics of Angiogenesis. Biol Proced Online. 4, 24-31 (2002).
- Caplan, A. I. Adult mesenchymal stem cells for tissue engineering versus regenerative medicine. J Cell Physiol. 213 (2), 341-347 (2007).
- Caplan, A. I., Dennis, J. E. Mesenchymal stem cells as trophic mediators. J Cell Biochem. 98 (5), 1076-1084 (2006).
- Keating, A. Mesenchymal stromal cells: new directions. Cell Stem Cell. 10 (6), 709-716 (2012).
- Kilroy, G. E., et al. Cytokine profile of human adipose-derived stem cells: expression of angiogenic, hematopoietic, and pro-inflammatory factors. J Cell Physiol. 212 (3), 702-709 (2007).
- Tang, Y. L., et al. Paracrine action enhances the effects of autologous mesenchymal stem cell transplantation on vascular regeneration in rat model of myocardial infarction. Ann Thorac Surg. 80 (1), 229-236 (2005).
- Caplan, A. I. All MSCs are pericytes?. Cell Stem Cell. 3 (3), 229-230 (2008).
- Hong, S. H., et al. Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation. Stem Cells Dev. 22 (17), 2425-2439 (2013).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: The ARRIVE guidelines for reporting animal research. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 94-99 (2010).
- Sarugaser, R., Ennis, J., Stanford, W. L., Davies, J. E. Isolation, propagation, and characterization of human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs). Methods Mol Biol. 482, 269-279 (2009).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Gelati, M., Aplin, A. C., Fogel, E., Smith, K. D., Nicosia, R. F. The angiogenic response of the aorta to injury and inflammatory cytokines requires macrophages. J Immunol. 181 (8), 5711-5719 (2008).
