Den murina kolin-brist, Ethionine-kompletteras (CDE) kost modell av kronisk leverskada
Summary
Här beskriver vi en gemensam metod för att framkalla kronisk leverskada hos möss genom utfodring av en kolin-brist och ethionine-kompletteras (CDE) kost. Vi visar hälsoövervakning, lever perfusion, isolering och bevarande. En dags kurs på sex veckor kan informera om leverskada, pathohistology, fibros, inflammatoriska, och levern progenitor cell svaren.
Abstract
Kroniska leversjukdomar, såsom viral hepatit, alkoholhaltiga leversjukdom eller alkoholfria fettlever, kännetecknas av ständig inflammation, progressiv förstörelse och regenerering av cellen nedsatt parenkymet, lever stamceller spridning och fibros. I slutstadiet av varje kronisk leversjukdom är cirros, en stor riskfaktor för utveckling av Hepatocellulär cancer. För att studera processer som reglerar sjukdom initiering, etablering och progression, används flera djurmodeller i laboratorier. Här beskriver vi en sex veckors tid kurs av kolin-brist och ethionine-kompletteras (CDE) musmodell, som innebär utfodring sex – vecka-gammal C57BL/6J hanmöss med kolin-brist chow och 0,15% DL-ethionine-kompletteras dricksvatten. Övervakning av djurens hälsa och en typisk kropp vikt förlust kurva förklaras. Protokollet visar brutto undersökningen av en CDE-behandlade lever och blod insamling av hjärt punktering för efterföljande serum analyser. Nästa, de lever perfusion teknik och samling av olika nedsatt lober standard utvärderingar är visas, inklusive levern histologiska bedömningar av hematoxylin och eosin eller Sirius röd infärgning, immunfluorescerande upptäckt av nedsatt cellpopulationer liksom transkriptom profilering av de lever mikromiljö. Denna musmodell är lämplig för studera inflammatoriska, fibrogenic och levern progenitor cell dynamics inducerad genom kronisk leversjukdom och kan användas för att testa potentiella terapeutiska medel som kan modulera dessa processer.
Introduction
Levern är den största glandular metaboliska orgeln i kroppen och har många komplexa funktioner. Viktiga roller för levern inkluderar matsmältning, ämnesomsättning, avgiftning, lagring av viktiga näringsämnen, produktion av blodplasma proteinkomponenter och immunitet som förmedlas genom bosatta makrofager eller Kupffers celler. Levern har en stor förmåga att regenerera även om upp till 70-90% av dess totala massa förloras. I händelse av akut leverskada, som sett efter en partiell hepatectomy eller paracetamol förgiftning, de återstående friska hepatocyterna föröka sig för att reparera skadan i en starkt samordnad process1. Dock när hepatocyterna är kroniskt skadad på grund av långvarig virusinfektion, alkoholhaltiga eller alkoholfria fettlever, den inflammatoriska mikromiljö utlöser aktivering av fibros-driving nedsatt stjärnformade celler och spridning av levern stamceller (LPCs) med potential att differentieras till antingen cholangiocytes eller hepatocyter2,3,4,5. Exakta ursprung, differentiering öde LPCs, deras bidrag till levern förnyelse och hepatocarcinogenesis har varit ämnen av intensiv debatt och troligen beror på skada svårighetsgrad och sammanhang2. Tidiga regenerering-associerade händelseordningen diskuteras också controversially, med vissa utredare som anger att nedsatt stjärnformade cellaktivering och matrix remodeling är väsentliga för generering av en LPC-gynnar nisch6, medan andra rapport att LPC expansion och den så kallade Ductular reaktionen är skyldiga att utlösa fibrogenes7. I området i närheten finns det många djurmodeller studera specifika aspekter av skada och förnyelse, i ett försök att förstå alla de underliggande faktorer som reglerar sjukdomsprogression och slutligen utveckla nya behandlingsstrategier för patienter8.
Kolin-brist och ethionine-kompletteras (CDE) dietary modellen var ursprungligen utvecklats för användning i råttor och senare ändrats för kronisk leverskada induktion i möss9,10. Dietary brist av kolin resulterar i försämrad församling och utsöndringen av mycket low-density lipoprotein. Kombinerat med hepatocarcinogen DL-ethionine, denna regim leder till överdriven hepatiskt fett lastning, kontinuerlig inflammation, periportal fibros, LPC svar och långsiktig hepatocellulära carcinom utveckling11,12 . Men ännu viktigare, annan mus stammar uppvisar distinkta mönster av inflammatoriska, fibrogenic och LPC svar dynamics13. Det här protokollet beskriver kronisk leverskada induktion i C57BL/6J möss, de vanligaste inavlade mus stam.
I kronisk leversjukdom forskning omfatta typiska analyser histologiska bedömningar av hematoxylin och eosin samt Sirius röd färgning för att visualisera kollagen depositioner, immunhistokemisk eller immunfluorescerande upptäckt av nedsatt cellpopulationer, och transcriptomic analyser av den levern närmiljön som orkestrerar de inducerade cellulära förändringarna genom komplexa tillväxtfaktor och cytokin nätverk14,15,16,17 , 18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kronisk leversjukdom är ofta en tyst sjukdom med de flesta patienter är asymtomatiska och det är en av de största bidragsgivarna till sjuklighet och dödlighet i hela världen. Kronisk alkoholism och hepatit C-infektion är de ledande orsakerna. Kronisk leverskada kännetecknas av nedsatt inflammation, fibros och i svåra fall cirros, cancer och slutligen leversvikt. Det finns för närvarande inget botemedel och även om stora framsteg har gjorts för att förstå mekanismerna leversjukdom, nya terapeutiska möjligh…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av bidrag från de nationella hälso- och medicinsk forskning rådet (NHMRC) Australien (APP1042370, APP1061332, APP1087125). Författarna vill tacka Curtin hälsa Innovation Research Institute personal för tekniskt bistånd.
Materials
| Six-week-old male C57BL/6J mice | Animal Resource Centre of Western Australia, Murdoch, WA, Australia | N/A | |
| 10 Kg Steam Cut Wheaten Chaff | Specialty Feeds, Glen Forrest, WA, Australia | N/A | |
| Water for irrigation 1000ml bottle (Baxter) | Surgical House, Perth, WA, Australia | AHF7114A | |
| Choline- deficient diet, modified (pellets) | MP Biomedicals Australasia Pty Limited, WA, Australia 02960210 | ||
| DL-Ethionine | Sigma-Aldrich, Castle Hill, NSW, Australia | E5139-25G | |
| Ketamil injection | Troy Laboratories Pty Limited, Glendenning, NSW, Australia | N/A | |
| Ilum Xylazil-20 injection | Troy Laboratories Pty Limited, Glendenning, NSW, Australia | N/A | |
| 27G x 1/2", Regular Wall Needle | Terumo Australia Pty Limited, NSW, Australia | NN-2713R | |
| Syringes Terumo 1ml and 10ml | Terumo Australia Pty Limited, Macquarie Park, NSW, Australia | 1018242, 1018037 | |
| Tissue-Tek OCT compound | VWR International Pty Limited, Tingalpa, QLD, Australia | 25608-930 | |
| Neutral buffered formalin | Amber Scientific, Midvale, WA, Australia | NBF-2.5L | |
| Ethanol absolute anaLaR normalpur | VWR International Pty Limited, Tingalpa, QLD, Australia | 20821.33 | |
| Superfrost Plus slides | Grale Scientific Pty Limited, Ringwood, VIC, Australia | SF41296SP | |
| Dako Protein Block, serum-free | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia | X090930-2 | |
| Dako antibody diluent | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia | s0809 | |
| rat anti-CD45 | eBioscience, San Diego, California, USA | m0701 | 1/200 dilution |
| rabbit anti-panCK | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia | Z0622 | 1/300 dilution |
| Goat anti-rabbit (Alexa Fluor 488) | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | A-11008 | 1/500 dilution |
| Goat anti-rat IgG (Alexa Fluor 594) | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | A-11007 | 1/500 dilution |
| ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | P36935 | |
| Picrosirius Red Stain Kit | Polysciences Inc., Warrington, PA, USA | ab150681 | |
Referências
- Taub, R. Liver regeneration: from myth to mechanism. Nat Rev Mol Cell Biol. 5, 836-847 (2004).
- Kohn-Gaone, J., Gogoi-Tiwari, J., Ramm, G. A., Olynyk, J. K., Tirnitz-Parker, J. E. The role of liver progenitor cells during liver regeneration, fibrogenesis, and carcinogenesis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 310, G143-G154 (2016).
- Lu, W. Y., et al. Hepatic progenitor cells of biliary origin with liver repopulation capacity. Nat Cell Biol. 17, 971-983 (2015).
- Prakoso, E., et al. Analysis of the intrahepatic ductular reaction and progenitor cell responses in hepatitis C virus recurrence after liver transplantation. Liver Transpl. 20, 1508-1519 (2014).
- Tirnitz-Parker, J. E., Tonkin, J. N., Knight, B., Olynyk, J. K., Yeoh, G. C. Isolation, culture and immortalisation of hepatic oval cells from adult mice fed a choline-deficient, ethionine-supplemented diet. Int J Biochem Cell Biol. 39, 2226-2239 (2007).
- Van Hul, N. K., Abarca-Quinones, J., Sempoux, C., Horsmans, Y., Leclercq, I. A. Relation between liver progenitor cell expansion and extracellular matrix deposition in a CDE-induced murine model of chronic liver injury. Hepatology. 49, 1625-1635 (2009).
- Clouston, A. D., et al. Fibrosis correlates with a ductular reaction in hepatitis C: roles of impaired replication, progenitor cells and steatosis. Hepatology. 41, 809-818 (2005).
- Forbes, S. J., Newsome, P. N. Liver regeneration – mechanisms and models to clinical application. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 13, 473-485 (2016).
- Akhurst, B., et al. A modified choline-deficient, ethionine-supplemented diet protocol effectively induces oval cells in mouse liver. Hepatology. 34, 519-522 (2001).
- Shinozuka, H., Lombardi, B., Sell, S., Iammarino, R. M. Early histological and functional alterations of ethionine liver carcinogenesis in rats fed a choline-deficient diet. Cancer Res. 38, 1092-1098 (1978).
- Knight, B., Tirnitz-Parker, J. E., Olynyk, J. K. C-kit inhibition by imatinib mesylate attenuates progenitor cell expansion and inhibits liver tumor formation in mice. Gastroenterology. 135, 969-979 (2008).
- Kohn-Gaone, J., et al. Divergent Inflammatory, Fibrogenic, and Liver Progenitor Cell Dynamics in Two Common Mouse Models of Chronic Liver Injury. Am J Pathol. 186, 1762-1774 (2016).
- Knight, B., et al. Attenuated liver progenitor (oval) cell and fibrogenic responses to the choline deficient, ethionine supplemented diet in the BALB/c inbred strain of mice. J Hepatol. 46, 134-141 (2007).
- Dwyer, B. J., Olynyk, J. K., Ramm, G. A., Tirnitz-Parker, J. E. TWEAK and LTbeta Signaling during Chronic Liver Disease. Front Immunol. 5, 39 (2014).
- Karin, M., Clevers, H. Reparative inflammation takes charge of tissue regeneration. Nature. 529, 307-315 (2016).
- Ruddell, R. G., et al. Lymphotoxin-beta receptor signaling regulates hepatic stellate cell function and wound healing in a murine model of chronic liver injury. Hepatology. 49, 227-239 (2009).
- Tirnitz-Parker, J. E., et al. Tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis is a mitogen for liver progenitor cells. Hepatology. 52, 291-302 (2010).
- Viebahn, C. S., Yeoh, G. C. What fires prometheus? The link between inflammation and regeneration following chronic liver injury. Int J Biochem Cell Biol. 40, 855-873 (2008).
- Hayner, N. T., Braun, L., Yaswen, P., Brooks, M., Fausto, N. Isozyme profiles of oval cells, parenchymal cells, and biliary cells isolated by centrifugal elutriation from normal and preneoplastic livers. Cancer Res. 44, 332-338 (1984).
- Tee, L. B., Smith, P. G., Yeoh, G. C. Expression of alpha, mu and pi class glutathione S-transferases in oval and ductal cells in liver of rats placed on a choline-deficient, ethionine-supplemented diet. Carcinogenesis. 13, 1879-1885 (1992).
- Chayanupatkul, M., et al. Hepatocellular carcinoma in the absence of cirrhosis in patients with chronic hepatitis B virus infection. J Hepatol. 66, 355-362 (2017).
- Mittal, S., et al. Hepatocellular Carcinoma in the Absence of Cirrhosis in United States Veterans is Associated With Nonalcoholic Fatty Liver Disease. Clin Gastroenterol Hepatol. 14, 124-131 (2016).
