La murino colina-carenti, etionina-completati (CDE) dieta modello della lesione epatica cronica
Summary
Qui descriviamo un metodo comune per indurre la lesione cronica del fegato nei topi di alimentazione di una dieta di colina-carenti ed etionina-completati (CDE). Dimostriamo che la sorveglianza sanitaria, aspersione epatica, isolamento e conservazione. Un corso di sei settimane di tempo può informare circa il disturbo al fegato, pathohistology, fibrosi, infiammatoria e risposte delle cellule progenitrici del fegato.
Abstract
Malattie croniche del fegato, come epatite virale, malattie epatiche alcoliche o analcoliche steatosi epatica, sono caratterizzate da infiammazione continua, progressiva distruzione e rigenerazione della cellula progenitore parenchima epatico, fegato proliferazione e fibrosi. Lo stadio terminale di ogni malattia cronica del fegato è la cirrosi, un fattore di rischio importante per lo sviluppo di carcinoma epatocellulare. Per studiare i processi che regolano la progressione, istituzione e l’inizio di malattia, parecchi modelli animali sono utilizzati nei laboratori. Qui descriviamo un corso di sei settimane di tempo di colina-carenti ed etionina-completati (CDE) modello del topo, che coinvolge sei – settimana-vecchio topo C57BL/6J maschio di alimentazione con colina-carente chow e 0,15% DL-etionina-completati di acqua potabile. Monitoraggio della salute degli animali e una curva di perdita di peso corpo tipici sono spiegati. Il protocollo dimostra l’esame lordo di una collezione di fegato e del sangue di CDE-trattati dalla puntura cardiaca per le analisi successive del siero. Successivamente, la tecnica di aspersione del fegato e la raccolta di diversi lobi epatici per valutazioni standard sono indicati, tra cui l’istologia del fegato valutazioni di ematossilina ed eosina o Sirius Red stainings, immunofluorescente rilevamento delle popolazioni delle cellule epatiche così come transcriptome analisi del microambiente del fegato. Questo modello di mouse è adatto per studiare infiammatoria, fibrogenici e cellula del progenitor del fegato dinamica indotta attraverso l’affezione epatica cronica e può essere utilizzato per verificare potenziali agenti terapeutici che possono modulare questi processi.
Introduction
Il fegato è il più grande organo ghiandolare metabolico del corpo ed ha molte funzioni complesse. Ruoli chiave per il fegato includono la digestione, metabolismo, disintossicazione, deposito di nutrienti essenziali, produzione di componenti proteiche del plasma sanguigno e immunità mediata attraverso residenti macrofagi o cellule di Kupffer. Il fegato ha una grande capacità di rigenerare anche se fino al 70-90% della sua massa totale è perduto. In caso di lesioni epatiche acute, come visto in seguito epatectomia parziale o avvelenamento dell’acetaminofene, gli epatociti sani rimanenti proliferano per riparare il danno in un processo altamente coordinata1. Tuttavia, quando gli epatociti sono cronicamente feriti a causa di infezione virale a lungo termine, alcoliche o analcoliche steatosi epatica, il microambiente infiammatorio innesca l’attivazione delle cellule stellate epatiche fibrosi-guida e la proliferazione delle cellule del progenitor del fegato (LPCs) con la capacità di differenziarsi in colangiociti o epatociti2,3,4,5. L’origine precisa, fato differenziativo di LPCs, loro contributo alla rigenerazione del fegato e nell’epatocarcinogenesi sono stati argomenti di dibattito intenso e molto probabilmente dipendono dalla gravità del pregiudizio e contesto2. L’ordine dei primi eventi di rigenerazione-collegata è discussa anche discutibile, con alcuni ricercatori che indica che l’attivazione delle cellule stellate epatiche e rimodellamento della matrice è essenziale per la generazione di una LPC-favorendo nicchia6, mentre gli altri relazione che sono richiesti a grilletto fibrogenesis7espansione LPC e la cosiddetta reazione duttulare. Ci sono numerosi modelli animali per studiare aspetti specifici della lesione e la rigenerazione, nel tentativo di comprendere tutti i fattori di fondo che regolano la progressione della malattia e, infine, sviluppare nuove strategie di trattamento per pazienti8.
Il modello dietetico (CDE) colina-carenti ed etionina-completato è stato originariamente sviluppato per l’uso in ratti e successivamente modificato per induzione di lesione cronica del fegato in topi9,10. La carenza dietetica di colina provoca montaggio alterato e secrezione di lipoproteine a bassa densità molto. Combinato con l’epatocarcinogeno DL-etionina, questo regime conduce ad eccessivo grasso epatico caricamento, continua infiammazione, fibrosi periportal, LPC risposta e a lungo termine al carcinoma epatocellulare sviluppo,11,12 . Tuttavia, cosa importante, ceppi murini diversi presentano modelli distintivi di infiammatorio, fibrogenici e LPC risposta dinamica13. Questo protocollo descrive la razza del topo di disturbo al fegato cronico induzione in topi C57BL/6J, il più comunemente usato innato.
Nella ricerca di affezione epatica cronica, analisi tipiche includono valutazioni istologiche di ematossilina ed eosina nonché di Sirius Red macchiatura per visualizzare deposizioni di collagene, immunohistochemical o immunofluorescente rilevamento delle popolazioni di cellule epatiche, e analisi trascrittomica del microambiente del fegato che orchestra i cambiamenti cellulari indotti attraverso il complesso fattore di crescita e citochine reti14,15,16,17 , 18.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’affezione epatica cronica è spesso una malattia silenziosa con maggior parte dei pazienti sono asintomatici ed è uno dei maggiori contributori alla morbilità e mortalità in tutto il mondo. L’alcolismo cronico e l’infezione del virus dell’epatite C sono le principali cause. Lesione epatica cronica è caratterizzata da infiammazione epatica, fibrosi e nei casi più gravi cirrosi, carcinoma e insufficienza epatica in definitiva. Non esiste attualmente una cura disponibile e anche se sono stati compiuti progressi impor…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Health and Medical Research Consiglio (NHMRC) dell’Australia (APP1042370, APP1061332, APP1087125). Gli autori vorrei ringraziare il personale di Curtin Health Innovation Research Institute per l’assistenza tecnica.
Materials
| Six-week-old male C57BL/6J mice | Animal Resource Centre of Western Australia, Murdoch, WA, Australia | N/A | |
| 10 Kg Steam Cut Wheaten Chaff | Specialty Feeds, Glen Forrest, WA, Australia | N/A | |
| Water for irrigation 1000ml bottle (Baxter) | Surgical House, Perth, WA, Australia | AHF7114A | |
| Choline- deficient diet, modified (pellets) | MP Biomedicals Australasia Pty Limited, WA, Australia 02960210 | ||
| DL-Ethionine | Sigma-Aldrich, Castle Hill, NSW, Australia | E5139-25G | |
| Ketamil injection | Troy Laboratories Pty Limited, Glendenning, NSW, Australia | N/A | |
| Ilum Xylazil-20 injection | Troy Laboratories Pty Limited, Glendenning, NSW, Australia | N/A | |
| 27G x 1/2", Regular Wall Needle | Terumo Australia Pty Limited, NSW, Australia | NN-2713R | |
| Syringes Terumo 1ml and 10ml | Terumo Australia Pty Limited, Macquarie Park, NSW, Australia | 1018242, 1018037 | |
| Tissue-Tek OCT compound | VWR International Pty Limited, Tingalpa, QLD, Australia | 25608-930 | |
| Neutral buffered formalin | Amber Scientific, Midvale, WA, Australia | NBF-2.5L | |
| Ethanol absolute anaLaR normalpur | VWR International Pty Limited, Tingalpa, QLD, Australia | 20821.33 | |
| Superfrost Plus slides | Grale Scientific Pty Limited, Ringwood, VIC, Australia | SF41296SP | |
| Dako Protein Block, serum-free | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia | X090930-2 | |
| Dako antibody diluent | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia | s0809 | |
| rat anti-CD45 | eBioscience, San Diego, California, USA | m0701 | 1/200 dilution |
| rabbit anti-panCK | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia | Z0622 | 1/300 dilution |
| Goat anti-rabbit (Alexa Fluor 488) | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | A-11008 | 1/500 dilution |
| Goat anti-rat IgG (Alexa Fluor 594) | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | A-11007 | 1/500 dilution |
| ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | P36935 | |
| Picrosirius Red Stain Kit | Polysciences Inc., Warrington, PA, USA | ab150681 | |
Referências
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