O murino colina deficiente, Ethionine-completada (CDE) dieta modelo de lesão hepática crônica
Summary
Aqui nós descrevemos um método comum para induzir lesão hepática crônica em ratos, alimentando-se de uma dieta deficiente em colina e ethionine-complementado do (CDE). Demonstramos que o monitoramento de integridade, perfusão hepática, isolamento e preservação. Um curso de tempo de seis semanas pode informar sobre a lesão hepática, pathohistology, fibrose, inflamatória e respostas de células progenitoras de fígado.
Abstract
Doenças crônicas do fígado, como hepatite viral, doença hepática alcoólica ou doença hepática gordurosa não-alcoólica, são caracterizadas por inflamação contínua, destruição progressiva e regeneração da célula progenitora de parênquima hepático, fígado proliferação e fibrose. O estágio final de cada doença crónica do fígado é a cirrose, um importante factor de risco para o desenvolvimento de carcinoma hepatocelular. Para estudar os processos que regulam a progressão, estabelecimento e iniciação da doença, vários modelos animais são utilizados em laboratórios. Aqui descrevemos um curso de seis semanas de tempo do deficiente em colina e ethionine-completados (CDE) modelo de mouse, que envolve seis semana de idade camundongos C57BL/6J machos de alimentação com deficiente em colina chow e 0,15% DL-ethionine-completar água potável. Monitoramento da saúde animal e uma curva de perda de peso de corpo típica são explicados. O protocolo demonstra a análise bruta de uma coleção de fígado e sangue CDE-tratados por punção cardíaca para análises subsequentes de soro. Em seguida, a técnica de perfusão de fígado e coleção de diferentes lóbulos hepáticos para avaliações padrão são mostrados, incluindo histologia hepática avaliações por hematoxilina e eosina ou Sirius vermelho citológicas, imunofluorescência deteção de populações de células hepáticas assim como transcriptome perfilamento do microambiente do fígado. Este modelo de rato é adequado para estudar inflamatória, fibrogênicos e células progenitoras fígado dinâmica induzida através de doença hepática crônica e pode ser usada para testar potenciais agentes terapêuticos que podem modular a estes processos.
Introduction
O fígado é o maior órgão glandular de metabólico do corpo e tem muitas funções complexas. Papéis-chave para o fígado incluem a digestão, desintoxicação, metabolismo, armazenamento de nutrientes essenciais, produção de componentes de proteínas do plasma sanguíneo e imunidade mediada por macrófagos residentes ou células de Kupffer. O fígado tem uma grande capacidade de se regenerar mesmo que cerca de 70-90% da sua massa total é perdida. Em caso de lesão hepática aguda, como visto a seguir uma hepatectomy parcial ou paracetamol envenenamento, os restantes saudáveis hepatócitos proliferam para reparar os danos num processo altamente coordenada1. No entanto, quando os hepatócitos são cronicamente feridos devido a uma infecção viral a longo prazo, alcoólica ou não alcoólicas esteatose hepática, o microambiente inflamatório desencadeia a ativação das células estreladas hepáticas fibrose de condução e a proliferação de células progenitoras de fígado (LPCs) com o potencial de se diferenciar em hepatócitos ou cholangiocytes2,3,4,5. A origem exacta, destino de diferenciação da LPCs, contribuam para a regeneração hepática e hepatocarcinogenesis foram temas de debate intenso e provavelmente depende da gravidade da lesão e contexto2. A ordem dos eventos precoce associada a regeneração é discutida também controversa, com alguns investigadores, informando que a ativação de células estreladas hepáticas e remodelação da matriz é essencial para a geração de um LPC-favorecendo nicho6, enquanto outros relatório que a expansão do LPC e o so-called reação Ductular são necessários para gatilho fibrogenesis7. Existem inúmeros modelos animais para estudar aspectos específicos da lesão e regeneração, na tentativa de compreender todos os factores subjacentes que regulam a progressão da doença e, finalmente, desenvolver novas estratégias de tratamento para pacientes8.
O modelo dieta deficiente em colina e ethionine-completados (CDE) foi originalmente desenvolvido para uso em ratos e posteriormente modificado para indução de lesão hepática crônica em ratos9,10. Deficiência dietética de colina resulta em assembly prejudicada e secreção das lipoproteínas de baixa densidade muito. Combinado com o hepatocarcinogen DL-ethionine, este regime leva a excessiva gordura hepática, carregamento, inflamação contínua, fibrose periportal, resposta LPC e a longo prazo para hepatocelular carcinoma desenvolvimento11,12 . No entanto, importante, cepas de mouse diferente apresentam padrões distintos de inflamatórias, fibrogênicos e LPC resposta dinâmica13. Este protocolo descreve a cepa de rato de indução em camundongos C57BL/6J, o mais comumente usado e mais uns de lesão hepática crônica.
Na investigação de doença hepática crônica, análises típicas incluem avaliação histológica pela hematoxilina e eosina, bem como Sirius vermelho coloração para visualizar depoimentos de colágeno, imuno-histoquímica ou imunofluorescência detecção de populações de células hepáticas, e análises de transcriptomic do fígado microambiente que coordena as mudanças celulares induzidas pelo complexo fator de crescimento e citocinas redes14,15,16,17 , 18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Doença hepática crônica é muitas vezes uma doença silenciosa com a maioria dos pacientes, sendo assintomática e é um dos maiores contribuintes para a morbidade e mortalidade em todo o mundo. Alcoolismo crônico e infecção pelo vírus da hepatite C são as principais causas. Lesão hepática crônica é caracterizada por inflamação hepática, fibrose e em casos severos cirrose, carcinoma e, finalmente, cirrose. Atualmente não existe cura disponível e embora grandes avanços foram feitos para compreender os me…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por doações da saúde nacional e Conselho de pesquisa médica (NHMRC) da Austrália (APP1042370, APP1061332, APP1087125). Os autores gostaria de agradecer a equipe Curtin saúde inovação Research Institute para obter assistência técnica.
Materials
| Six-week-old male C57BL/6J mice | Animal Resource Centre of Western Australia, Murdoch, WA, Australia | N/A | |
| 10 Kg Steam Cut Wheaten Chaff | Specialty Feeds, Glen Forrest, WA, Australia | N/A | |
| Water for irrigation 1000ml bottle (Baxter) | Surgical House, Perth, WA, Australia | AHF7114A | |
| Choline- deficient diet, modified (pellets) | MP Biomedicals Australasia Pty Limited, WA, Australia 02960210 | ||
| DL-Ethionine | Sigma-Aldrich, Castle Hill, NSW, Australia | E5139-25G | |
| Ketamil injection | Troy Laboratories Pty Limited, Glendenning, NSW, Australia | N/A | |
| Ilum Xylazil-20 injection | Troy Laboratories Pty Limited, Glendenning, NSW, Australia | N/A | |
| 27G x 1/2", Regular Wall Needle | Terumo Australia Pty Limited, NSW, Australia | NN-2713R | |
| Syringes Terumo 1ml and 10ml | Terumo Australia Pty Limited, Macquarie Park, NSW, Australia | 1018242, 1018037 | |
| Tissue-Tek OCT compound | VWR International Pty Limited, Tingalpa, QLD, Australia | 25608-930 | |
| Neutral buffered formalin | Amber Scientific, Midvale, WA, Australia | NBF-2.5L | |
| Ethanol absolute anaLaR normalpur | VWR International Pty Limited, Tingalpa, QLD, Australia | 20821.33 | |
| Superfrost Plus slides | Grale Scientific Pty Limited, Ringwood, VIC, Australia | SF41296SP | |
| Dako Protein Block, serum-free | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia | X090930-2 | |
| Dako antibody diluent | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia | s0809 | |
| rat anti-CD45 | eBioscience, San Diego, California, USA | m0701 | 1/200 dilution |
| rabbit anti-panCK | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia | Z0622 | 1/300 dilution |
| Goat anti-rabbit (Alexa Fluor 488) | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | A-11008 | 1/500 dilution |
| Goat anti-rat IgG (Alexa Fluor 594) | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | A-11007 | 1/500 dilution |
| ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | P36935 | |
| Picrosirius Red Stain Kit | Polysciences Inc., Warrington, PA, USA | ab150681 | |
Referências
- Taub, R. Liver regeneration: from myth to mechanism. Nat Rev Mol Cell Biol. 5, 836-847 (2004).
- Kohn-Gaone, J., Gogoi-Tiwari, J., Ramm, G. A., Olynyk, J. K., Tirnitz-Parker, J. E. The role of liver progenitor cells during liver regeneration, fibrogenesis, and carcinogenesis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 310, G143-G154 (2016).
- Lu, W. Y., et al. Hepatic progenitor cells of biliary origin with liver repopulation capacity. Nat Cell Biol. 17, 971-983 (2015).
- Prakoso, E., et al. Analysis of the intrahepatic ductular reaction and progenitor cell responses in hepatitis C virus recurrence after liver transplantation. Liver Transpl. 20, 1508-1519 (2014).
- Tirnitz-Parker, J. E., Tonkin, J. N., Knight, B., Olynyk, J. K., Yeoh, G. C. Isolation, culture and immortalisation of hepatic oval cells from adult mice fed a choline-deficient, ethionine-supplemented diet. Int J Biochem Cell Biol. 39, 2226-2239 (2007).
- Van Hul, N. K., Abarca-Quinones, J., Sempoux, C., Horsmans, Y., Leclercq, I. A. Relation between liver progenitor cell expansion and extracellular matrix deposition in a CDE-induced murine model of chronic liver injury. Hepatology. 49, 1625-1635 (2009).
- Clouston, A. D., et al. Fibrosis correlates with a ductular reaction in hepatitis C: roles of impaired replication, progenitor cells and steatosis. Hepatology. 41, 809-818 (2005).
- Forbes, S. J., Newsome, P. N. Liver regeneration – mechanisms and models to clinical application. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 13, 473-485 (2016).
- Akhurst, B., et al. A modified choline-deficient, ethionine-supplemented diet protocol effectively induces oval cells in mouse liver. Hepatology. 34, 519-522 (2001).
- Shinozuka, H., Lombardi, B., Sell, S., Iammarino, R. M. Early histological and functional alterations of ethionine liver carcinogenesis in rats fed a choline-deficient diet. Cancer Res. 38, 1092-1098 (1978).
- Knight, B., Tirnitz-Parker, J. E., Olynyk, J. K. C-kit inhibition by imatinib mesylate attenuates progenitor cell expansion and inhibits liver tumor formation in mice. Gastroenterology. 135, 969-979 (2008).
- Kohn-Gaone, J., et al. Divergent Inflammatory, Fibrogenic, and Liver Progenitor Cell Dynamics in Two Common Mouse Models of Chronic Liver Injury. Am J Pathol. 186, 1762-1774 (2016).
- Knight, B., et al. Attenuated liver progenitor (oval) cell and fibrogenic responses to the choline deficient, ethionine supplemented diet in the BALB/c inbred strain of mice. J Hepatol. 46, 134-141 (2007).
- Dwyer, B. J., Olynyk, J. K., Ramm, G. A., Tirnitz-Parker, J. E. TWEAK and LTbeta Signaling during Chronic Liver Disease. Front Immunol. 5, 39 (2014).
- Karin, M., Clevers, H. Reparative inflammation takes charge of tissue regeneration. Nature. 529, 307-315 (2016).
- Ruddell, R. G., et al. Lymphotoxin-beta receptor signaling regulates hepatic stellate cell function and wound healing in a murine model of chronic liver injury. Hepatology. 49, 227-239 (2009).
- Tirnitz-Parker, J. E., et al. Tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis is a mitogen for liver progenitor cells. Hepatology. 52, 291-302 (2010).
- Viebahn, C. S., Yeoh, G. C. What fires prometheus? The link between inflammation and regeneration following chronic liver injury. Int J Biochem Cell Biol. 40, 855-873 (2008).
- Hayner, N. T., Braun, L., Yaswen, P., Brooks, M., Fausto, N. Isozyme profiles of oval cells, parenchymal cells, and biliary cells isolated by centrifugal elutriation from normal and preneoplastic livers. Cancer Res. 44, 332-338 (1984).
- Tee, L. B., Smith, P. G., Yeoh, G. C. Expression of alpha, mu and pi class glutathione S-transferases in oval and ductal cells in liver of rats placed on a choline-deficient, ethionine-supplemented diet. Carcinogenesis. 13, 1879-1885 (1992).
- Chayanupatkul, M., et al. Hepatocellular carcinoma in the absence of cirrhosis in patients with chronic hepatitis B virus infection. J Hepatol. 66, 355-362 (2017).
- Mittal, S., et al. Hepatocellular Carcinoma in the Absence of Cirrhosis in United States Veterans is Associated With Nonalcoholic Fatty Liver Disease. Clin Gastroenterol Hepatol. 14, 124-131 (2016).
