تحليل دقيق والفائق للنمو البكتيري
Summary
التقييم الكمي للنمو البكتيري أمر ضروري لفهم فسيولوجيا الميكروبات كظاهرة مستوى النظم. يتم إدخال بروتوكول للتلاعب التجريبية ونهج تحليلي، مما يسمح للتحليل الدقيق، الفائق للنمو البكتيرية، التي موضع اهتمام في بيولوجيا الأنظمة رئيسية.
Abstract
النمو الجرثومي مفهوم مركزي في التنمية لفسيولوجيا الميكروبات الحديثة، وكذلك في التحقيق في ديناميات الخلوية على مستوى النظم. وأفادت الدراسات الأخيرة المتبادلة بين النمو البكتيري والأحداث على نطاق الجينوم، مثل الجينوم الترنسكربيتوم والحد من عملية إعادة التنظيم. تحليل النمو البكتيري بشكل صحيح أمر حيوي لفهم النمو تعتمد على تنسيق وظائف الجينات والمكونات الخلوية. وبناء على ذلك، مطلوب التقييم الكمي الدقيق للنمو البكتيري في طريقة الفائق. التطورات التكنولوجية الناشئة توفر الأدوات التجريبية الجديدة التي تسمح تحديثات الأساليب المستخدمة في دراسة النمو الجرثومي. البروتوكول أدخل هنا يستخدم قارئ ميكروسكوبية مع إجراء تجريبي الغاية أمثل لتقييم النمو البكتيري استنساخه ودقيقة. استخدم هذا البروتوكول لتقييم نمو عدة سبق وصف سلالات الإشريكيّة القولونية . الخطوات الرئيسية للبروتوكول على ما يلي: إعداد عدد كبير من مخزون الخلية في قارورة صغيرة للاختبارات المتكررة مع النتائج استنساخه، واستخدام لوحات 96-جيدا لتقييم النمو الفائق، والحساب اليدوي الرئيسية اثنين المعلمات (أي، الكثافة السكانية ومعدل النمو القصوى) تمثل ديناميات النمو. بالمقارنة التقليدية مستعمرة-تشكيل وحدة (زيمبابوي) المقايسة، الذي عد الخلايا التي تستزرع في أنابيب زجاجية على مر الزمن في لوحات أجار، الأسلوب الحالي هو أكثر كفاءة وتوفر السجلات الزمنية أكثر تفصيلاً لتغيرات النمو، ولكن صرامة حد الكشف في الكثافة السكانية المنخفضة. وباختصار، الأسلوب وصف مفيد لتحليل الفائق الدقة واستنساخه النمو البكتيرية، والتي يمكن أن تستخدم لاستخلاص استنتاجات مفاهيمية أو إبداء الملاحظات النظرية.
Introduction
غالباً ما تبدأ الدراسات الميكروبيولوجية مع ثقافة الخلايا البكتيرية وتقييم منحنيات النمو البكتيرية، التي تمثل ظاهرة أساسية لفسيولوجيا البكتيريا1،،من23. مبادئ الثقافة الأساسية متاحة على نطاق واسع في الأدب الأبحاث المنشورة والكتب المدرسية لأن ثقافة البكتيرية منهجية أساسية. على مستوى مقاعد البدلاء، اهتماما كبيرا ركزت تقليديا على الاستفادة المثلى من وسائط النمو واستزراع الشروط، ولكن السيطرة على معدل النمو، الذي سيوفر يرجح أن فهم أكبر لفسيولوجيا الميكروبات، لم يكن 4من درس على نطاق واسع. هو معلمة رئيسية للدولة الخلوية لزراعة البكتيريا أضعافاً مضاعفة، معدل النمو، الذي تم الإبلاغ عن أن تكون منسقة مع الجينوم، الترنسكربيتوم، والبروتين5،،من67،8 . وهكذا، التقييم الكمي للنمو البكتيري أمر حاسم لفهم فسيولوجيا الميكروبات.
تقييم النمو البكتيري، الأساليب التجريبية المستخدمة لتقدير الكتلة الحيوية راسخة9،10 وتقوم على الكشف عن المعلمات البيوكيميائية أو الفيزيائية أو البيولوجية، مثل تعكر الضوئية. وباﻹضافة إلى ذلك، الأساليب التحليلية المستخدمة لالتقاط الخصائص الديناميكية لتغيرات النمو عادة استناداً إلى النماذج غير الخطية الثابتة11،12،13، معادلات السوقي، على سبيل المثال،. عموما تكتسب ديناميات النمو بتوقيت أخذ العينات من نمو الخلايا في الثقافة بقياس التعكر الضوئية أو إجراء فحوصات وحدة (زيمبابوي) تشكيل مستعمرة. الحد من هذه الأساليب استزراع والكشف أن نقاط البيانات ليست انعكاسا حقيقيا للديناميات السكانية لأن فترات القياس غالباً في ساعات، ونظرا لحالة الثقافة (مثلاً، والتغيرات في درجة الحرارة و ويساور التهوية) في وقت أخذ العينات. يجب تحديث تقنيات الثقافة والتحليل باستخدام التطورات الأخيرة في مجال التكنولوجيا والتفاهم. التقدم الذي أحرز مؤخرا في القراء الميكروسكوبية تسمح المراقبة في الوقت الحقيقي من النمو البكتيري وانخفاض تكاليف العمالة إلى حد كبير. استخدام هذه الأجهزة المتقدمة، أفادت آخر الدراسات على النمو البكتيري الأساليب التحليلية للقياسات الفائق14،15.
والغرض من هذا البروتوكول هو تقييم ديناميات النمو دقيقة بطريقة الفائق، التي سوف تكون ذات قيمة للدراسات الكمية التي تعالج المسائل المتعلقة بكيفية تحديد معدل النمو وما هي العوامل التي تؤثر على معدل النمو في نهاية المطاف. ويتناول البروتوكول جميع العوامل التي ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار كوانتيتيشن قابل للتكرار ودقيقة للنمو البكتيري. ويرد بالتفصيل في النص الرئيسي الأسلوب التجريبي والتحليل. هذا الأسلوب يسمح تحليل دقيق واستنساخه من النمو البكتيري في طريقة الفائق. الأطباء استخدام هذا البروتوكول لاستخلاص نتائج كمية إضافية من تلك الأدلة التجريبية. يمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول للدراسات في بيولوجيا الأنظمة التي تسعى إلى استخلاص استنتاجات مفاهيمية أو لتحقيق نظرة نظرية للنمو.
Protocol
Representative Results
Discussion
وتشمل الخطوات الحاسمة في البروتوكول إعداد الأسهم المشتركة أضعافاً مضاعفة زراعة الخلايا وتكرار نفس العينات في آبار متعددة في مختلف المواقف بشأن الميكروسكوبية. في السابق، بدأ الأطباء الثقافة من ثقافة ما قبل بين عشية وضحاها. وبينما قد يقلل هذا الأسلوب وقت تأخر النمو البكتيري، من الصعب تحقي…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Materials
| K2HPO4 | Wako | 164-04295 | |
| KH2PO4 | Wako | 166-04255 | |
| (NH4)2SO4 | Wako | 019-03435 | |
| MgSO4-7H2O | Wako | 138-00415 | |
| Thiamine-HCl | Wako | 201-00852 | |
| glucose | Wako | 049-31165 | |
| HCl | Wako | 080-01066 | |
| Iron (II) sulfate heptahydrate (FeSO4-7H2O) | Wako | 094-01082 | |
| KOH | Wako | 168-21815 | |
| Glycerol | Wako | 075-00611 | |
| Centrifuge tube (50 mL, sterilized) | WATSON | 1342-050S | |
| Pipette Tips, 200 µL | WATSON | 110-705Y | |
| Pipette Tips, 1000 µL | WATSON | 110-8040 | |
| Microtube (1.5 mL) | WATSON | 131-715C | |
| 8 multichannel-pipette | WATSON | NT-8200 | |
| PASORINA STIRRER | AS ONE | 2-4990-02 | |
| Glass cylinder (200 mL) | AS ONE | 1-8562-07 | |
| Precision pH mater | AS ONE | AS800 / 1-054-01 | |
| Pipetman P-200 | GILSON | 1-6855-05 | |
| Pipetman P-1000 | GILSON | 1-6855-06 | |
| Disposable Serolocical Pipettes (10 mL) | SANPLATEC | SAN27014 | |
| Disposable Serolocical Pipettes (25 mL) | SANPLATEC | SAN27015 | |
| Microtube stand | BM Bio | 801-02Y | |
| Vortex | BM Bio | BM-V1 | |
| Corning Costar 96-well microplate with lid (Flat bottom, Clear) | Sigma-Aldrich | Corning, 3370 | |
| Corning Costar reagent reservoir (50 mL) | Sigma-Aldrich | Corning, 4870 | |
| Stericup GV PVDF (250 mL, 0.22 µM) | Merck Millipore | SCGVU02RE | |
| Pipet-Aid XP | DRUMMOND | 4-000-101 | |
| Bioshaker (BR-23UM MR) | TAITEC | 0053778-000 | |
| Disposal cell (1.5 mL) | Kartell | 1938 / 2-478-02 | |
| DU 730 Life Science UV/Vis Spectrophotometer | Beckman Coulter | A23616 | |
| EPOCH2 | BioTek | 2014-EP2-002 / EPOCH2T | |
| Beaker (500 mL) | IWAKI | 82-0008 | |
| BIO clean bench | Panasonic | MCV-B131F | |
| Glass tubes | NICHIDEN RIKA GLASS | P-10M~P-30 /101019 | |
| Silicone rubber stoppers | ShinEtsu Polymer | T-19 | |
| Bacterial strains | Strain bank organization; National Bio Resource Project (NBRP) in Japan |
Referências
- Kovarova-Kovar, K., Egli, T. Growth kinetics of suspended microbial cells: from single-substrate-controlled growth to mixed-substrate kinetics. Microbiol Mol Biol Rev. 62 (3), 646-666 (1998).
- Soupene, E., et al. Physiological studies of Escherichia coli strain MG1655: growth defects and apparent cross-regulation of gene expression. J Bacteriol. 185 (18), 5611-5626 (2003).
- Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D’Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J Bacteriol. 189 (23), 8746-8749 (2007).
- Egli, T. Microbial growth and physiology: a call for better craftsmanship. Front Microbiol. 6, 287 (2015).
- Kurokawa, M., Seno, S., Matsuda, H., Ying, B. W. Correlation between genome reduction and bacterial growth. DNA Res. 23 (6), 517-525 (2016).
- Matsumoto, Y., Murakami, Y., Tsuru, S., Ying, B. W., Yomo, T. Growth rate-coordinated transcriptome reorganization in bacteria. BMC Genomics. 14, 808 (2013).
- Nahku, R., et al. Specific growth rate dependent transcriptome profiling of Escherichia coli K12 MG1655 in accelerostat cultures. J Biotechnol. 145 (1), 60-65 (2010).
- Dai, X., et al. Reduction of translating ribosomes enables Escherichia coli to maintain elongation rates during slow growth. Nat Microbiol. 2, 16231 (2016).
- Madrid, R. E., Felice, C. J. Microbial biomass estimation. Crit Rev Biotechnol. 25 (3), 97-112 (2005).
- Harris, C. M., Kell, D. B. The estimation of microbial biomass. Biosensors. 1 (1), 17-84 (1985).
- Yates, G. T., Smotzer, T. On the lag phase and initial decline of microbial growth curves. J Theor Biol. 244 (3), 511-517 (2007).
- Kargi, F. Re-interpretation of the logistic equation for batch microbial growth in relation to Monod kinetics. Lett Appl Microbiol. 48 (4), 398-401 (2009).
- Peleg, M., Corradini, M. G. Microbial growth curves: what the models tell us and what they cannot. Crit Rev Food Sci Nutr. 51 (10), 917-945 (2011).
- Sprouffske, K., Wagner, A. Growthcurver: an R package for obtaining interpretable metrics from microbial growth curves. BMC Bioinformatics. 17, 172 (2016).
- Hall, B. G., Acar, H., Nandipati, A., Barlow, M. Growth rates made easy. Mol Biol Evol. 31 (1), 232-238 (2014).
- Hermsen, R., Okano, H., You, C., Werner, N., Hwa, T. A growth-rate composition formula for the growth of E.coli on co-utilized carbon substrates. Mol Syst Biol. 11 (4), 801 (2015).
- Engen, S., Saether, B. E. r- and K-selection in fluctuating populations is determined by the evolutionary trade-off between two fitness measures: Growth rate and lifetime reproductive success. Evolution. 71 (1), 167-173 (2017).
