세균성 성장의 정확한, 높은 처리량 분석
Summary
세균성 성장의 양적 평가 시스템 수준 현상으로 미생물 생리학을 이해 하는 데 필수적입니다. 실험적인 조작 및 분석 접근 프로토콜, 세균성 성장, 시스템 생물학의 핵심 주제는의 정확한, 높은 처리량 분석에 대 한 허용 소개.
Abstract
세균성 성장 시스템 수준에서 세포 역학 조사에서 뿐만 아니라 현대 미생물 생리학의 발달에 중앙 개념 이다. 최근 연구는 세균성 성장 및 게놈 감소와 transcriptome 개편 같은 게놈 넓은 이벤트 사이의 상관 관계를 보고 했다. 올바르게 박테리아의 성장을 분석 유전자 기능 및 세포 구성 성분의 성장-종속 조정 이해 결정적 이다. 따라서, 높은 처리량으로 세균 성장의 정확한 정량적 인 평가 필요 합니다. 신흥 기술 개발 공부 하는 박테리아의 성장을 위해 사용 하는 방법의 업데이트를 허용 하는 새로운 실험 도구를 제공 합니다. 여기 소개 하는 프로토콜 세균성 성장의 재현 하 고 정확한 평가 위해 고도로 최적화 된 실험적인 절차 microplate 리더를 사용 합니다. 이 프로토콜의 성장을 평가 하는 데 사용 되었다 대장균 변종 설명한. 프로토콜의 주요 단계는 다음과 같습니다: 재현할 결과와 높은 처리량 성장 평가 96 잘 접시를 사용 하 여, 두 가지 주요의 수동 계산 반복된 테스트에 대 한 작은 튜브에서 셀 주식의 많은 수의 준비 매개 변수 (즉, 최대 성장 속도 인구 밀도) 성장 역학을 나타내는. 전통적인 식민지 형성 단위 (CFU) 분석 결과, 한 천 배지에서 시간이 지남에 따라 유리 튜브에 교양 있는 셀을 계산, 비교 현재의 방법 보다 효율적 고 성장 변화, 자세한 시간 레코드를 제공 합니다 하지만 엄격한 낮은 인구 밀도에 검색 제한입니다. 요약, 설명된 방법 개념적 결론 또는 이론적 관찰 하도록 이용 될 수 있는 세균 성장의 정확 하 고 재현성 높은 처리량 분석을 위해 유리 하다.
Introduction
미생물 연구는 종종 세균 세포의 문화, 그리고 세균 생리학1,2,3의 기본적인 현상을 대표 하는 세균성 성장 곡선의 평가로 시작 합니다. 세균성 문화는 근본적인 방법론 때문에 기본적인 문화 원리 교과서 출판된 연구 문학에 널리 사용할 수 있습니다. 벤치 수준에서 상당한 관심은 전통적으로에 초점을 맞춘 성장 미디어 최적화와 배양 조건, 하지만 성장 속도 제어는 미생물 생리학의 더 큰 이해를 제공할 것입니다 가능성이 되지 않았습니다. 광범위 하 게 공부4. 기 하 급수적으로 성장 하는 박테리아, 세포의 주요 매개 변수는 성장률, 게놈, transcriptome와 프로테옴5,6,7,8 조정 될 것으로 보고 되었습니다. . 따라서, 세균성 성장의 양적 평가 미생물 생리학을 이해 결정적 이다.
세균성 성장 평가, 바이오 매스를 추정 하는 데 사용 하는 실험 방법 잘 설립된9,10 있으며 광 탁 등, 물리적, 생화학 또는 생물 학적 매개 변수의 탐지에 기반. 또한, 성장 변경의 동적 속성을 캡처하는 데 사용 하는 분석 방법 설립된 비선형 모델11,,1213, 예를 들어 로지스틱 방정식에 일반적으로 근거한 다. 성장 역학 광 탁도 측정 하거나 콜로 니 형성 단위 (CFU) 분석 실험을 수행 하 여 셀 성장 문화에서의 시간된 샘플링에 의해 일반적으로 획득 됩니다. 이러한 배양 및 검출 방법의 한계는 데이터 요소는 없습니다 인구 역학의 진정한 반사 측정 간격 시간에 종종 있기 때문에 때문에 문화 조건 (예를 들어, 온도 변경 및 통 기 통풍) 샘플링 시간에 교란 된다. 문화 및 분석 기술은 최근 개발 기술 및 이해를 사용 하 여 업데이트 해야 합니다. Microplate 리더의 최근 발전 세균 성장의 실시간 관찰을 허용 하 고 노동 비용을 크게 감소. 이러한 고급 장치를 사용 하 여, 세균성 성장에 대 한 최신 연구는 높은 처리량 측정14,15에 대 한 분석 방법 보고.
이 프로토콜의 목적은 궁극적으로 어떻게 성장 율 결정 되 고 어떤 요인에 영향을 미치는 성장 율의 질문 하는 양적 연구에 대 한 가치가 있을 것입니다 높은 처리 방식으로 정확한 성장 역학을 평가 하는 것입니다. 프로토콜 세균 성장의 반복 가능 하 고 정확한 정량에 대 한 계정으로 이동 해야 하는 모든 요소를 해결 합니다. 실험 방법 및 분석 주요 텍스트에서 자세히 설명 합니다. 이 메서드는 높은 처리량 방법에서 세균 성장의 정확 하 고 재현성 분석을 허용합니다. 미생물학은 그들의 실험적인 증거 추가 양적 결과 파생이 프로토콜을 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 개념적 결론 또는 성장에 대 한 이론적 개요를 달성 하기 위해 시도 하는 시스템 생물학에서 연구를 위해 사용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
프로토콜에 중요 한 단계는 기 하 급수적으로 성장 하는 세포와 같은 샘플은 microplate에 다양 한 위치에서 여러 우물에서의 복제의 보통주 준비 포함 됩니다. 이전, 미생물학 하룻밤 사전 문화에서 문화를 시작 했다. 이 방법은 세균 성장의 지연 시간을 줄일 수 있습니다, 하는 동안 재현할 수 성장 곡선을 달성 하기 어렵다. 그림 2에서 같이 거의 동일한 성장 곡선, 재현할 수 ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 공개 없다.
Materials
| K2HPO4 | Wako | 164-04295 | |
| KH2PO4 | Wako | 166-04255 | |
| (NH4)2SO4 | Wako | 019-03435 | |
| MgSO4-7H2O | Wako | 138-00415 | |
| Thiamine-HCl | Wako | 201-00852 | |
| glucose | Wako | 049-31165 | |
| HCl | Wako | 080-01066 | |
| Iron (II) sulfate heptahydrate (FeSO4-7H2O) | Wako | 094-01082 | |
| KOH | Wako | 168-21815 | |
| Glycerol | Wako | 075-00611 | |
| Centrifuge tube (50 mL, sterilized) | WATSON | 1342-050S | |
| Pipette Tips, 200 µL | WATSON | 110-705Y | |
| Pipette Tips, 1000 µL | WATSON | 110-8040 | |
| Microtube (1.5 mL) | WATSON | 131-715C | |
| 8 multichannel-pipette | WATSON | NT-8200 | |
| PASORINA STIRRER | AS ONE | 2-4990-02 | |
| Glass cylinder (200 mL) | AS ONE | 1-8562-07 | |
| Precision pH mater | AS ONE | AS800 / 1-054-01 | |
| Pipetman P-200 | GILSON | 1-6855-05 | |
| Pipetman P-1000 | GILSON | 1-6855-06 | |
| Disposable Serolocical Pipettes (10 mL) | SANPLATEC | SAN27014 | |
| Disposable Serolocical Pipettes (25 mL) | SANPLATEC | SAN27015 | |
| Microtube stand | BM Bio | 801-02Y | |
| Vortex | BM Bio | BM-V1 | |
| Corning Costar 96-well microplate with lid (Flat bottom, Clear) | Sigma-Aldrich | Corning, 3370 | |
| Corning Costar reagent reservoir (50 mL) | Sigma-Aldrich | Corning, 4870 | |
| Stericup GV PVDF (250 mL, 0.22 µM) | Merck Millipore | SCGVU02RE | |
| Pipet-Aid XP | DRUMMOND | 4-000-101 | |
| Bioshaker (BR-23UM MR) | TAITEC | 0053778-000 | |
| Disposal cell (1.5 mL) | Kartell | 1938 / 2-478-02 | |
| DU 730 Life Science UV/Vis Spectrophotometer | Beckman Coulter | A23616 | |
| EPOCH2 | BioTek | 2014-EP2-002 / EPOCH2T | |
| Beaker (500 mL) | IWAKI | 82-0008 | |
| BIO clean bench | Panasonic | MCV-B131F | |
| Glass tubes | NICHIDEN RIKA GLASS | P-10M~P-30 /101019 | |
| Silicone rubber stoppers | ShinEtsu Polymer | T-19 | |
| Bacterial strains | Strain bank organization; National Bio Resource Project (NBRP) in Japan |
Referências
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