Präzise, Hochdurchsatz-Analyse des Bakterienwachstums
Summary
Quantitative Bewertung des Bakterienwachstums unbedingt mikrobielle Physiologie als Systemebene Phänomen zu verstehen. Ein Protokoll für experimentelle Manipulation und ein analytischer Ansatz eingeführt, ermöglicht präzise, Hochdurchsatz-Analyse der bakteriellen Wachstum, das ist ein zentrales Thema des Interesses in der Systembiologie.
Abstract
Bakterielles Wachstum ist ein zentrales Konzept in der Entwicklung der modernen mikrobielle Physiologie, sowie bei der Untersuchung der zelluläre Dynamik auf der Systemebene. Jüngste Studien haben Zusammenhänge zwischen Bakterienwachstum und genomweite Ereignisse, z. B. Genom Reduktion und Transkriptom Reorganisation berichtet. Richtig analysieren Bakterienwachstum ist entscheidend für das Verständnis der Wachstum-abhängige Koordination von Genfunktionen und zellulären Komponenten. Dementsprechend ist die präzise quantitative Auswertung des Bakterienwachstums in gewissem Sinne Hochdurchsatz-erforderlich. Neue technologische Entwicklungen bieten neue experimentelle Tools, die Updates über die Methoden zur Untersuchung von Bakterienwachstum zu ermöglichen. Die hier vorgestellte Protokoll beschäftigt einen Mikrotestplatte Leser mit einem hochoptimierten experimentelle Verfahren für die präzise und reproduzierbare Auswertung des Bakterienwachstums. Dieses Protokoll wurde verwendet, um das Wachstum von mehreren Werten zuvor beschriebenen Escherichia-coli -Stämme. Die wichtigsten Schritte des Protokolls sind wie folgt: die Vorbereitung einer großen Anzahl der Zelle Bestände in kleinen Fläschchen für wiederholte Prüfungen mit reproduzierbaren Ergebnissen, die Verwendung von 96-Well Platten für Hochdurchsatz-Wachstum-Bewertung und die manuelle Berechnung von zwei großen Parameter (d.h. maximale Wachstum Rate und Bevölkerung Dichte) repräsentieren die Wachstumsdynamik. Im Vergleich zu den traditionellen koloniebildenden Einheit (KBE) Assay, der die Zellen, die in Glasröhren im Laufe der Zeit auf Agarplatten kultiviert werden zählt, die vorliegende Methode ist effizienter und bietet detailliertere zeitliche Aufzeichnungen über Wachstum Veränderungen, aber hat eine strengere Nachweisgrenze bei niedrigen Bevölkerungsdichte. Zusammenfassend ist das beschriebene Verfahren vorteilhaft für die präzise und reproduzierbare Hochdurchsatz-Analyse des bakteriellen Wachstums, der konzeptionellen Schlussfolgerungen ziehen oder theoretische Bemerkungen verwendet werden kann.
Introduction
Mikrobiologische Untersuchungen beginnen oft mit der Kultur der Bakterienzellen und der Bewertung der Bakterienwachstum Kurven, die ein grundlegendes Phänomen der bakteriellen Physiologie1,2,3darstellen. Grundlegende Kultur Prinzipien sind weit verbreitet in der veröffentlichten Literatur und Lehrbücher, weil Bakterienkultur eine grundlegende Methodik ist. Die Ebene der Bank erhebliche Aufmerksamkeit hat traditionell auf die Optimierung Wachstumsmedien und Kultivierung Bedingungen, sondern steuern die Wachstumsrate, die wahrscheinlich noch größeres Verständnis für mikrobielle Physiologie bieten würde wurde nicht ausgiebig studiert4. Für exponentiell wachsenden Bakterien, ist ein wichtiger Parameter der zellulären Staat die Wachstumsrate, die berichtet wurde, das Genom, Transkriptom und Proteom5,6,7,8 abgestimmt sein . So ist die quantitative Bewertung des Bakterienwachstums entscheidend für das Verständnis der mikrobielle Physiologie.
Um bakterielles Wachstum zu bewerten, die experimentellen Methoden zur Schätzung der Biomasse sind gut etablierte9,10 und basieren auf dem Nachweis von biochemischen, physikalische oder biologische Parameter, z. B. optische Trübung. Darüber hinaus basieren die analytischen Methoden verwendet, um die dynamischen Eigenschaften des Wachstums Änderungen erfassen häufig auf etablierte nichtlineare Modelle11,12,13, z. B. logistische Gleichungen. Wachstumsdynamik sind in der Regel durch zeitgesteuerte Sampling des Zellwachstums in der Kultur durch optische Trübungsmessung oder Durchführung von koloniebildenden Einheit (KBE) Assays erworben. Die Einschränkung dieser Kultivierung und Erkennung Methoden ist, dass die Datenpunkte kein getreues Spiegelbild der Populationsdynamik sind, da die Messintervalle oft in Stunden sind und die Kultur-Bedingung (z. B.Veränderungen in Temperatur und Belüftung) ist zum Zeitpunkt der Probenahme gestört. Kultur und Analysetechniken müssen aktualisiert werden, mit den letzten Entwicklungen in Technologie und Verständnis. Jüngste Fortschritte in der Mikrotestplatte Leser erlauben die Echtzeit-Beobachtung des Bakterienwachstums und Arbeitskosten deutlich zu verringern. Mit diesen fortschrittlichen Geräten, haben die neuesten Studien über Bakterienwachstum Analysemethoden für Hochdurchsatz-Messungen14,15berichtet.
Dieses Protokoll soll die genaue Wachstumsdynamik in gewissem Hochdurchsatz-bewerten, die quantitative Studien nützlich sein werden, die letztlich die Fragen wie die Wachstumsrate bestimmt wird und welche Faktoren beeinflussen die Wachstumsrate. Das Protokoll befasst sich mit allen Faktoren, die für die reproduzierbare und genaue Quantifizierung des Bakterienwachstums berücksichtigt werden sollten. Die experimentelle Methode und Analyse sind detailliert im Haupttext beschrieben. Diese Methode erlaubt die präzise und reproduzierbare Analyse des Bakterienwachstums in gewissem Sinne Hochdurchsatz. Mikrobiologen können dieses Protokoll verwenden, um zusätzliche quantitative Ergebnisse aus ihrer experimentellen Beweise ableiten. Dieses Protokoll kann auch für Studien in der Systembiologie verwendet werden, die versuchen, konzeptionellen Schlussfolgerungen zu ziehen oder einen theoretischen Überblick über Wachstum zu erreichen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wichtige Schritte im Protokoll sind die Vorbereitung einer Stammaktie der exponentiell wachsenden Zellen und die Replikation der gleichen Proben in mehreren Brunnen an verschiedenen Positionen auf die Mikrotestplatte. Zuvor, Mikrobiologen die Kultur angefangen eine Übernachtung Vorkultur. Während diese Methode die Verzögerungszeit des Bakterienwachstums verringern kann, ist es schwierig, reproduzierbare Wachstumskurven zu erreichen. Wie in Abbildung 2dargestellt, führte die unabhängigen…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Materials
| K2HPO4 | Wako | 164-04295 | |
| KH2PO4 | Wako | 166-04255 | |
| (NH4)2SO4 | Wako | 019-03435 | |
| MgSO4-7H2O | Wako | 138-00415 | |
| Thiamine-HCl | Wako | 201-00852 | |
| glucose | Wako | 049-31165 | |
| HCl | Wako | 080-01066 | |
| Iron (II) sulfate heptahydrate (FeSO4-7H2O) | Wako | 094-01082 | |
| KOH | Wako | 168-21815 | |
| Glycerol | Wako | 075-00611 | |
| Centrifuge tube (50 mL, sterilized) | WATSON | 1342-050S | |
| Pipette Tips, 200 µL | WATSON | 110-705Y | |
| Pipette Tips, 1000 µL | WATSON | 110-8040 | |
| Microtube (1.5 mL) | WATSON | 131-715C | |
| 8 multichannel-pipette | WATSON | NT-8200 | |
| PASORINA STIRRER | AS ONE | 2-4990-02 | |
| Glass cylinder (200 mL) | AS ONE | 1-8562-07 | |
| Precision pH mater | AS ONE | AS800 / 1-054-01 | |
| Pipetman P-200 | GILSON | 1-6855-05 | |
| Pipetman P-1000 | GILSON | 1-6855-06 | |
| Disposable Serolocical Pipettes (10 mL) | SANPLATEC | SAN27014 | |
| Disposable Serolocical Pipettes (25 mL) | SANPLATEC | SAN27015 | |
| Microtube stand | BM Bio | 801-02Y | |
| Vortex | BM Bio | BM-V1 | |
| Corning Costar 96-well microplate with lid (Flat bottom, Clear) | Sigma-Aldrich | Corning, 3370 | |
| Corning Costar reagent reservoir (50 mL) | Sigma-Aldrich | Corning, 4870 | |
| Stericup GV PVDF (250 mL, 0.22 µM) | Merck Millipore | SCGVU02RE | |
| Pipet-Aid XP | DRUMMOND | 4-000-101 | |
| Bioshaker (BR-23UM MR) | TAITEC | 0053778-000 | |
| Disposal cell (1.5 mL) | Kartell | 1938 / 2-478-02 | |
| DU 730 Life Science UV/Vis Spectrophotometer | Beckman Coulter | A23616 | |
| EPOCH2 | BioTek | 2014-EP2-002 / EPOCH2T | |
| Beaker (500 mL) | IWAKI | 82-0008 | |
| BIO clean bench | Panasonic | MCV-B131F | |
| Glass tubes | NICHIDEN RIKA GLASS | P-10M~P-30 /101019 | |
| Silicone rubber stoppers | ShinEtsu Polymer | T-19 | |
| Bacterial strains | Strain bank organization; National Bio Resource Project (NBRP) in Japan |
Referências
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