Análisis precisos, alto rendimiento de crecimiento bacteriano
Summary
Evaluación cuantitativa del crecimiento bacteriano es fundamental para entender la fisiología microbiana como un fenómeno de nivel de sistemas. Se introduce un protocolo de manipulación experimental y un enfoque analítico, permitiendo análisis precisos, alto rendimiento de crecimiento bacteriano, que es un tema clave de interés en biología de sistemas.
Abstract
Crecimiento bacteriano es un concepto central en el desarrollo de la moderna fisiología microbiana, así como en la investigación de la dinámica celular a nivel de sistemas. Estudios recientes han reportado correlaciones entre el crecimiento bacteriano y eventos de todo el genoma, como reorganización de reducción y transcriptoma de genoma. Analizar correctamente el crecimiento bacteriano es fundamental para entender la coordinación dependiente del crecimiento de las funciones de genes y componentes celulares. Por consiguiente, se requiere la evaluación cuantitativa precisa del crecimiento bacteriano en forma de alto rendimiento. Desarrollos tecnológicos emergentes ofrecen nuevas herramientas experimentales que permiten la actualización de los métodos utilizados para el estudio de crecimiento bacteriano. El protocolo introducido el emplea a un lector de microplacas con un procedimiento experimental altamente optimizado para la evaluación precisa y reproducible del crecimiento bacteriano. Este protocolo fue utilizado para evaluar el crecimiento de varias cepas de Escherichia coli ha descrito anteriormente. Los pasos principales del protocolo son las siguientes: la elaboración de un gran número de poblaciones de células en pequeños viales de repetidas pruebas con la reproducibilidad, la utilización de placas de 96 pocillos para la evaluación del crecimiento de alto rendimiento y el cálculo manual de dos grandes parámetros (es decir, densidad de población y tasa de crecimiento máxima) que representa la dinámica de crecimiento. En comparación con el tradicional análisis de unidad (UFC) formadoras de colonias, que cuenta con las células que se cultivan en tubos de vidrio con el tiempo en placas de agar, el presente método es más eficiente y proporciona más registros temporales de los cambios de crecimiento, pero tiene una más estricta límite de detección a densidades de población bajas. En Resumen, el método descrito es ventajoso para el análisis de alto rendimiento precisa y reproducible del crecimiento bacteriano, que puede utilizarse para sacar conclusiones conceptuales o hacer observaciones teóricas.
Introduction
Estudios microbiológicos a menudo comienzan con el cultivo de las células bacterianas y la evaluación de las curvas de crecimiento bacteriano, que representan un fenómeno fundamental de la fisiología bacteriana1,2,3. Principios básicos de la cultura están ampliamente disponibles en la literatura de los estudios publicados y los libros de texto porque la cultura bacteriana es una metodología fundamental. A nivel Banco, considerable atención se ha centrado tradicionalmente en optimización de medios de cultivo y condiciones de cultivo, pero controla la tasa de crecimiento, que probablemente daría aún mayor comprensión de la fisiología microbiana, no ha sido ampliamente estudiados4. Para el crecimiento exponencial de bacterias, un parámetro clave del estado celular es la tasa de crecimiento, que se ha divulgado para ser coordinado con el genoma, transcriptoma y proteoma5,6,7,8 . Así, la evaluación cuantitativa del crecimiento bacteriano es crucial para la comprensión de fisiología microbiana.
Para evaluar el crecimiento bacteriano, los métodos experimentales utilizados para estimar la biomasa están bien establecidos9,10 y se basan en la detección de parámetros bioquímicos, físicos o biológicos, como la turbidez óptica. Además, los métodos analíticos utilizados para capturar las propiedades dinámicas de los cambios de crecimiento se basan comúnmente en modelos no lineales establecidos11,12,13, por ejemplo, las ecuaciones logísticas. Dinámica de crecimiento se adquiere generalmente por tiempo muestreo del crecimiento celular en cultivo por medición de turbidez óptica o realizar pruebas de unidad (UFC) formadoras de colonias. La limitación de estos métodos de cultivo y detección es que los puntos no son un fiel reflejo de la dinámica de la población porque los intervalos de medición son a menudo en horas y la condición de la cultura (p. ej., cambios de temperatura y aireación) se altera en el momento de muestreo. Técnicas de cultivo y análisis deben ser actualizadas con los acontecimientos recientes en la tecnología y la comprensión. Los avances recientes en los lectores de microplacas permiten la observación en tiempo real del crecimiento bacteriano y disminuyen significativamente los costos laborales. Usando estos dispositivos avanzados, los estudios más recientes sobre crecimiento bacteriano han publicado métodos analíticos para mediciones de alto rendimiento14,15.
El propósito de este protocolo es evaluar la dinámica de crecimiento precisa de una manera de alto rendimiento, que será de gran valor para estudios cuantitativos que en última instancia, responder las preguntas de cómo se determina la tasa de crecimiento y los factores que afectan la tasa de crecimiento. El protocolo aborda todos los factores que deben tenerse en cuenta para la cuantificación precisa y repetible de crecimiento bacteriano. El método experimental y el análisis se describen en detalle en el texto principal. Este método permite el análisis preciso y reproducible de crecimiento bacteriano en forma de alto rendimiento. Microbiólogos pueden utilizar este protocolo para obtener resultados cuantitativos adicionales de su evidencia experimental. Este protocolo también puede utilizarse para estudios en biología de sistemas que tratan de sacar conclusiones conceptuales o para lograr un resumen teórico de crecimiento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pasos críticos en el protocolo incluyen la preparación de una acción común de crecimiento exponencial las células y la replicación de las mismas muestras en pozos múltiples en diversas posiciones en la microplaca. Previamente, microbiólogos comenzaron la cultura de una cultura de la noche. Mientras que este método puede reducir el tiempo de retraso del crecimiento bacteriano, es difícil de conseguir las curvas de crecimiento reproductivo. Como se muestra en la figura 2, las medicio…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores no tienen nada que revelar.
Materials
| K2HPO4 | Wako | 164-04295 | |
| KH2PO4 | Wako | 166-04255 | |
| (NH4)2SO4 | Wako | 019-03435 | |
| MgSO4-7H2O | Wako | 138-00415 | |
| Thiamine-HCl | Wako | 201-00852 | |
| glucose | Wako | 049-31165 | |
| HCl | Wako | 080-01066 | |
| Iron (II) sulfate heptahydrate (FeSO4-7H2O) | Wako | 094-01082 | |
| KOH | Wako | 168-21815 | |
| Glycerol | Wako | 075-00611 | |
| Centrifuge tube (50 mL, sterilized) | WATSON | 1342-050S | |
| Pipette Tips, 200 µL | WATSON | 110-705Y | |
| Pipette Tips, 1000 µL | WATSON | 110-8040 | |
| Microtube (1.5 mL) | WATSON | 131-715C | |
| 8 multichannel-pipette | WATSON | NT-8200 | |
| PASORINA STIRRER | AS ONE | 2-4990-02 | |
| Glass cylinder (200 mL) | AS ONE | 1-8562-07 | |
| Precision pH mater | AS ONE | AS800 / 1-054-01 | |
| Pipetman P-200 | GILSON | 1-6855-05 | |
| Pipetman P-1000 | GILSON | 1-6855-06 | |
| Disposable Serolocical Pipettes (10 mL) | SANPLATEC | SAN27014 | |
| Disposable Serolocical Pipettes (25 mL) | SANPLATEC | SAN27015 | |
| Microtube stand | BM Bio | 801-02Y | |
| Vortex | BM Bio | BM-V1 | |
| Corning Costar 96-well microplate with lid (Flat bottom, Clear) | Sigma-Aldrich | Corning, 3370 | |
| Corning Costar reagent reservoir (50 mL) | Sigma-Aldrich | Corning, 4870 | |
| Stericup GV PVDF (250 mL, 0.22 µM) | Merck Millipore | SCGVU02RE | |
| Pipet-Aid XP | DRUMMOND | 4-000-101 | |
| Bioshaker (BR-23UM MR) | TAITEC | 0053778-000 | |
| Disposal cell (1.5 mL) | Kartell | 1938 / 2-478-02 | |
| DU 730 Life Science UV/Vis Spectrophotometer | Beckman Coulter | A23616 | |
| EPOCH2 | BioTek | 2014-EP2-002 / EPOCH2T | |
| Beaker (500 mL) | IWAKI | 82-0008 | |
| BIO clean bench | Panasonic | MCV-B131F | |
| Glass tubes | NICHIDEN RIKA GLASS | P-10M~P-30 /101019 | |
| Silicone rubber stoppers | ShinEtsu Polymer | T-19 | |
| Bacterial strains | Strain bank organization; National Bio Resource Project (NBRP) in Japan |
Referências
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