Quantifizierung der menschliche Monocyte Chemotaxis In Vitro und murinen Lymphozyten Menschenhandel In Vivo
Summary
Protokolle für die quantitative Bewertung der Lymphozyten Chemotaxis und Migration sind wichtige Werkzeuge für die Immunologie Forschung. Hier wird eine in-vitro- Protokoll beschrieben, dass Genehmigungen in Echtzeit, Multiplex, Bewertung von Zellwanderung sowie eine ergänzende in Vivo Technik ermöglicht Tracking von native Zellen Milz.
Abstract
Chemotaxis ist die Migration auf eine spezifische chemische Gradienten1. Chemokine sind chemotaktische Zytokine, die Förderung der zellulären Menschenhandel mit anatomischen und zeitlichen Spezifität2. Chemotaxis ist eine kritische Funktion von Lymphozyten und anderen Immunzellen, die quantitativ bewertet in Vitro. Dieses Manuskript beschreibt Methoden, die die Beurteilung der Chemotaxis, erlauben sowohl in Vitro und in Vivo, für unterschiedliche Zelltypen, einschließlich Zell-Linien und native Zellen. Die in-vitro-, Platte-basiertes Format ermöglicht den Vergleich von mehreren Bedingungen gleichzeitig in Echtzeit und können innerhalb von 1-4 h. In Vitro Assay Bedingungen manipuliert werden, vorzustellen, Agonisten und Antagonisten, wie erfolgen sowie unterscheiden Sie Chemotaxis von Chemokinese, ist die zufällige Bewegung. Für in Vivo Menschenhandel Bewertungen können für Adoptiveltern übertragen Immunzellen mit mehreren Fluoreszenzfarbstoffen markiert und verwendet werden. Die unterschiedliche Kennzeichnung von Zellen ermöglicht gemischte Zellpopulationen im selben Tier, dadurch abnehmende Varianz und Reduzierung der Anzahl der Tiere für ein angemessen angetriebene Experiment eingefügt werden soll. Migration in lymphatischen Gewebe tritt in weniger als 1 h, und mehrere Gewebe Fächer können Sie probieren. Durchflusszytometrie Gewebe Ernte folgt ermöglicht eine schnelle und quantitative Analyse der wandernden Muster aus mehreren Zelltypen.
Introduction
Robuste Immunität erfordert die komplexe zeitliche und räumliche Koordination einer Vielzahl von Zelltypen, um entsprechend reagieren auf eine Verletzung, Infektion und Selbsttoleranz erzeugen. Mehrere Dutzend Chemokin-Rezeptoren und ihrer entsprechenden Liganden wurden entdeckt und charakterisierte die molekulare Mechanismen durch den spezifischen Zellen können zu einem bestimmten Zeitpunkt in einem bestimmten Gewebe geleitet werden. Studium Chemotaxis und Migration ist somit ein unverzichtbarer Bestandteil der Immunologie Forschung. In der Tat wurde der beschriebenen in-vitro- Test vor kurzem als Screening-Instrument zur chemotaktische Cofaktor zu identifizieren, die Chemotaxis von T-Zellen in Richtung C-C Chemokine 19 und 213beschleunigt. Der Zweck der hier beschriebenen Methoden sind quantitative Bewertungen der Immunzelle Chemotaxis in Vitro und in Vivozu ermöglichen.
Die Boyden (Zelle Migration und Invasion) Kammer-Assay ist eine kostengünstige, reproduzierbare und schnelle Methode für die Bewertung der Zelle Migration4,5. In der standard-Assay die obere Kammer ist mit Zellen ausgesät, und ist durch eine poröse Einlage aus einem unteren Kammer, in die die Zellen Wandern getrennt. Zum gewünschten Zeitpunkt können Zellen, die an der Unterseite des Einsatzes migriert wurden behoben und gebeizt für Quantifizierung von Lichtmikroskopie. Jedoch solche Messungen Datenerhebung auf einer einzigen Endpunkt, der dynamische Datenerfassung schließt zu beschränken und können erfordern umfangreiche Optimierung den optimale Zeitpunkt für die Analyse zu bestimmen. Hier werden verschiedene Anpassungen beschrieben, die in Echtzeit, quantitative und Multiplex Messungen der Chemotaxis in Vitrozu ermöglichen.
Für in Vivo Studien ist ein funktionelle Endpunkt verwendet, nämlich die spezifischen Anhäufung von Zellen in einem bestimmten Gewebe-Fach. Bereits beschriftete Spenderzellen werden in Empfänger Tiere durch Adoptiveltern Transfer eingeführt. Diese Spenderzellen können anschließend durch Durchflusszytometrie nach Empfänger Gewebe Ernte identifiziert werden. Auch ist eine Co Kennzeichnung Strategie, die für die Bestimmung des Handels mit verschiedenen Zelltypen innerhalb einer einzigen Empfänger Tier erlaubt. Diese Methode beseitigt die Inter Tiere Variation aus Zelle Injektion und Konten für physiologische Variabilität zwischen Tier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Quantifizierung der Immunzelle Migration kann erreicht werden, mit einfachen und schnellen Tests in Vitro und in Vivo. Wir zeigen die in Vitro Chemotaxis von menschlichen Monozyten als Reaktion auf eine MCP-1 Steigung und Vermehrung von Serum. In Vivo, Spender murinen Splenocyten waren differentiell beschriftet und anschließend Adoptiveltern waren Empfänger Tiere erholt.
Mit einem Teller-Reader hat den Vorteil, mehrere Zeit Probenahmestellen (so oft wie al…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von Bernard L. Schwartz Programm für Arzt-Wissenschaftler an der Rockefeller University, des therapeutischen Entwicklungsfonds Robertson an der Rockefeller University und die Sackler Center für Biomedizin und Ernährungsforschung an unterstützt die Rockefeller Universität.
Materials
| RPMI-1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875-093 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| Fetal Bovine Serum | ATCC | 30-2020 | |
| Cell culture flask | Corning | 353136 | |
| Calcein AM | Thermo Fisher Scientific | C1430 | Excitation: 485nm, Emission: 520nm |
| Cell culture dish | Corning | 1007 | |
| 24 well plate | Corning | 353504 | |
| Fluoroblok Fibronectin Insert | Corning | CB354597 | |
| 15 mL conical tube | Corning | 352097 | |
| Bovine Serum Albumin | Cell Signaling Technology | 9998S | |
| Human Recombinant MCP-1 | Peprotech | 300-04 | |
| Adult bovine Serum | Sigma | B9433 | |
| HBSS with calcium and magnesium; no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| SpectraMax M2e plate reader | Molecular Devices | ||
| Olympus IX71 inverted fluorescence microscope | Olympus | ||
| Isothesia | Henry Schein animal health | 11695-6776-2 | Isofluorane anesthesia |
| Cell strainer 40um nylon | Falcon Corning | 352340 | |
| ACK lysing buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
| CellTracker Orange CMTMR Dye | Thermo Fisher Scientific | C2927 | Excitation: 541nm, Emission: 565nm |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Thermo Fisher Scientific | C2925 | Excitation: 485nm, Emission: 520nm |
| 5ml syringe | BD Syringe | 309646 | |
| 1ml TB syringe | BD Syringe | 309625 | |
| THP-1 cell line | ATCC | TIB-202 | |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100228 | Excitation: 405nm, Emission: 421nm |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD19 Antibody | Biolegend | 115540 | Excitation: 405nm, Emission: 603nm |
| 96-well round bottom plate | Corning | 353077 | |
| LSRII | BD Biosciences | Flow cytometer |
Referências
- Griffith, J. W., Sokol, C. L., Luster, A. D. Chemokines and chemokine receptors: positioning cells for host defense and immunity. Annu Rev Immunol. 32, 659-702 (2014).
- Springer, T. A. Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm. Cell. 76 (2), 301-314 (1994).
- Ponda, M. P., Breslow, J. L. Serum stimulation of CCR7 chemotaxis due to coagulation factor XIIa-dependent production of high-molecular-weight kininogen domain 5. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (45), E7059-E7068 (2016).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J Exp Med. 115, 453-466 (1962).
- Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).
- Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, Y., Kobayashi, Y., Konno, T., Tada, K. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
- Leonard, E. J., Yoshimura, T. Human monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1). Immunol Today. 11 (3), 97-101 (1990).
- Crouch, M. F. An automated fluorescence based assay of neurite formation. J Neurosci Methods. 104 (1), 87-91 (2000).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Poot, M., Kavanagh, T. J., Kang, H. C., Haugland, R. P., Rabinovitch, P. S. Flow cytometric analysis of cell cycle-dependent changes in cell thiol level by combining a new laser dye with Hoechst 33342. Cytometry. 12 (2), 184-187 (1991).
- West, C. A., He, C., Su, M., Swanson, S. J., Mentzer, S. J. Aldehyde fixation of thiol-reactive fluorescent cytoplasmic probes for tracking cell migration. J Histochem Cytochem. 49 (4), 511-518 (2001).
- Kim, C. H. The greater chemotactic network for lymphocyte trafficking: chemokines and beyond. Curr Opin Hematol. 12 (4), 298-304 (2005).
