Quantificazione del linfocita murino traffico In Vivo e chemiotassi del monocito umano In Vitro
Summary
Protocolli per la valutazione quantitativa della chemiotassi dei linfociti e la migrazione sono strumenti importanti per la ricerca in immunologia. Qui, un protocollo in vitro è descritto che permette in tempo reale, multiplexed valutazione della migrazione cellulare, così come un complementare in vivo tecnica abilitazione rilevamento di cellule native alla milza.
Abstract
La chemiotassi è migrazione lungo un gradiente chimico specifico1. Le chemochine sono citochine chemiotattiche che promuovono il traffico cellulare con specificità anatomiche e temporale2. La chemiotassi è una funzione critica dei linfociti e altre cellule immuni che possono essere quantitativamente valutata in vitro. Questo manoscritto descrive i metodi che consentono la valutazione della chemiotassi, sia in vitro che in vivo, per tipi cellulari diversi tra cui linee cellulari e cellule native. Lo in vitro, formato basato su piastra permette il confronto delle diverse condizioni contemporaneamente in tempo reale e può essere completato entro 1-4 h. In vitro analisi condizioni possono essere manipolate per introdurre gli agonisti e antagonisti, come bene come differenziare la chemiotassi da chemokinesis, che è il movimento casuale. Per le valutazioni traffico in vivo , le cellule immuni possono essere contrassegnate con le tinture fluorescenti più e utilizzate per trasferimento adottivo. L’etichettatura differenziale delle cellule consente di popolazioni di cellule miste ad essere introdotti nello stesso animale, quindi diminuendo la varianza e riducendo il numero di animali necessari per un esperimento adeguatamente alimentato. Migrazione nel tessuto linfoide si verifica in meno di 1 h e compartimenti multipli possono essere campionati. Citometria a flusso successivo vendemmia del tessuto permette un’analisi rapida e quantitativa dei flussi migratori di più tipi di cellule.
Introduction
Robusta immunità richiede il complesso coordinamento temporale e spaziale di una miriade di tipi di cellule al fine di rispondere in modo appropriato alla lesione, infezione e generare auto-tolleranza. Parecchi dozzina recettori per le chemochine e loro corrispondenti ligandi sono stati scoperti e caratterizzati fornendo meccanismi molecolari da cui le cellule specifiche possono essere diretto in un tessuto specifico in un momento specifico. Pertanto, studiare chemiotassi e migrazione è una componente indispensabile di ricerca in immunologia. Infatti, l’analisi descritta in vitro è stata recentemente usata come uno strumento di screening per identificare un cofattore chemiotattico che accelera la chemiotassi delle cellule T verso C-C chemochine 19 e 213. Lo scopo dei metodi descritti qui sono per consentire valutazioni quantitative della chemiotassi delle cellule immuni in vitro e in vivo.
L’analisi della camera di Boyden (migrazione cellulare e invasione) è un metodo poco costoso, riproducibile e rapido per valutare la migrazione cellulare4,5. In analisi standard, camera superiore è seminata con le cellule ed è separata da un inserto poroso da un alloggiamento più basso, in cui le cellule migrano. Al momento desiderato, le cellule che hanno migrato alla parte inferiore dell’inserto possono essere fissa e macchiate per quantificazione di microscopia chiara. Tuttavia, tali misure vincolano la raccolta di dati di un singolo punto di fine, che preclude la raccolta di dati dinamica e possono richiedere la vasta ottimizzazione per determinare il punto di tempo ottimale per l’analisi. Qui, diversi adattamenti sono descritti che consentono misurazioni in tempo reale, quantitative e multiplex di chemiotassi in vitro.
Per in vivo gli studi, viene utilizzato un punto di fine funzionale, vale a dire l’accumulo specifico delle cellule in un vano dato tessuto. Le cellule erogarici pre-etichettata vengono introdotti in animali destinatari attraverso trasferimento adottivo. Queste cellule del donatore possono essere identificate successivamente tramite flusso cytometry dopo il raccolto di destinatario del tessuto. È anche presentata una strategia co-etichettatura che consente per la determinazione del traffico di tipi differenti delle cellule all’interno di un singolo animale destinatario. Questo metodo elimina la variazione inter-animale da iniezione di cellule e conti per fisiologica variabilità.
Protocol
Representative Results
Discussion
Quantificazione della migrazione delle cellule immuni può essere compiuta usando semplice e veloce saggi sia in vitro che in vivo. Dimostriamo la chemiotassi in vitro di monociti umani in risposta un gradiente di MCP-1 e l’aumento di siero. In vivo, gli splenocytes murini donatore differenzialmente sono stati etichettati e a seguito di trasferimento adottivo, sono stati recuperati dal destinatari animali.
Utilizzando un lettore di piastra ha il vantaggio di…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dal programma di Bernard L. Schwartz per gli scienziati di medico presso la Rockefeller University, il fondo di sviluppo terapeutico Robertson presso la Rockefeller University e la Sackler Center per la biomedicina e nutrizione ricerca presso la Rockefeller University.
Materials
| RPMI-1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875-093 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| Fetal Bovine Serum | ATCC | 30-2020 | |
| Cell culture flask | Corning | 353136 | |
| Calcein AM | Thermo Fisher Scientific | C1430 | Excitation: 485nm, Emission: 520nm |
| Cell culture dish | Corning | 1007 | |
| 24 well plate | Corning | 353504 | |
| Fluoroblok Fibronectin Insert | Corning | CB354597 | |
| 15 mL conical tube | Corning | 352097 | |
| Bovine Serum Albumin | Cell Signaling Technology | 9998S | |
| Human Recombinant MCP-1 | Peprotech | 300-04 | |
| Adult bovine Serum | Sigma | B9433 | |
| HBSS with calcium and magnesium; no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| SpectraMax M2e plate reader | Molecular Devices | ||
| Olympus IX71 inverted fluorescence microscope | Olympus | ||
| Isothesia | Henry Schein animal health | 11695-6776-2 | Isofluorane anesthesia |
| Cell strainer 40um nylon | Falcon Corning | 352340 | |
| ACK lysing buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
| CellTracker Orange CMTMR Dye | Thermo Fisher Scientific | C2927 | Excitation: 541nm, Emission: 565nm |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Thermo Fisher Scientific | C2925 | Excitation: 485nm, Emission: 520nm |
| 5ml syringe | BD Syringe | 309646 | |
| 1ml TB syringe | BD Syringe | 309625 | |
| THP-1 cell line | ATCC | TIB-202 | |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100228 | Excitation: 405nm, Emission: 421nm |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD19 Antibody | Biolegend | 115540 | Excitation: 405nm, Emission: 603nm |
| 96-well round bottom plate | Corning | 353077 | |
| LSRII | BD Biosciences | Flow cytometer |
Referências
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