كفاءة توليد وتحرير إيبسكس تغذية خالية من خلايا البنكرياس البشرية باستخدام نظام كريسبر-Cas9
Summary
بروتوكول يصف بالتفصيل جيل خال من البصمة المستحثة pluripotent الخلايا الجذعية (إيبسكس) من خلايا البنكرياس البشرية في ظروف خالية من علبة التغذية بالورق، تبع هذا التحرير باستخدام ريبونوكليوبروتينس كريسبر/Cas9 وتوصيف لتعديل استنساخ الخلايا المفردة.
Abstract
يمكن أن الخلايا الجذعية الجنينية والمستحثه pluripotent الذاتي تجديد وتفرق في أنواع خلايا متعددة من الجسم. Pluripotent الخلايا وبالتالي هي مطمعا للبحوث في مجال الطب التجديدي، وحاليا في التجارب السريرية لأمراض العيون، والسكري، وأمراض القلب، والاضطرابات الأخرى. يمكن أن تفرق في أنواع الخلايا المتخصصة مقترنا بالتقدم الأخير في الجينوم تحرير التكنولوجيات بما في ذلك نظام كريسبر/Cas قد أتاحت فرصاً إضافية للخياطة الجينوم من اللجنة التوجيهية للتطبيقات المتنوعة بما في ذلك مرض النمذجة، والعلاج الجيني، ويتحامل مسارات التمايز، سبيل المثال لا الحصر. من بين التكنولوجيات المتاحة التحرير، برز كريسبر/Cas9 من العقدية المقيّحة كأداة للاختيار للتحرير الخاصة بالموقع لجينوم حقيقية النواة. كريسبرس يتم الوصول إليها بسهولة وغير مكلفة، وذات كفاءة عالية في هندسة عمليات التحرير المستهدفة. ويتطلب النظام نوكلياسي Cas9 ودليل تسلسل (20-مير) محددة الهدف الجينوم المتاخم 3-النوكليوتيدات “نج” بروتوسباسير-مجاورة-فكرة (بام) لاستهداف Cas9 إلى موضع الجينوم المرجوة، جنبا إلى جنب مع الراسم ملزمة Cas9 عالمي (الحمض النووي الريبي معا تسمى الحمض النووي الريبي دليل واحد أو سجرنا). نقدم هنا خطوة بخطوة بروتوكول لكفاءة توليد اللجنة التوجيهية وحدة تغذية مستقلة وخالية من البصمة ووصف منهجيات للجينوم التحرير للجنة التوجيهية باستخدام مجمعات ribonucleoprotein (رنب) Cas9. جينوم تحرير بروتوكول فعال ويمكن أن يكون متعدد بسهولة من قبل-إلى سجرناس لهدف واحد أو أكثر مع البروتين Cas9 وفي نفس الوقت تقديم في الخلايا. وأخيراً، يصف لنا اتباع نهج مبسطة لتحديد وتوصيف إيبسكس مع التعديلات المطلوبة. أخذت معا، الاستراتيجيات المحددة التي من المتوقع أن تبسيط إنشاء وتحرير للجنة التوجيهية لتطبيقات متعددة.
Introduction
إعادة برمجة الخلايا الجسدية البشرية للدولة pluripotent ب overexpression من إعادة برمجة العوامل قد أحدث ثورة في أبحاث الخلايا الجذعية مع تطبيقات في النمذجة المرض والطب التجديدي، وتطوير العقاقير. تتوفر عدة طرق إعادة برمجة غير الفيروسية لإنجاز إعادة برمجة العوامل وتوليد إيبسكس، ولكن هذه العملية هو العمل المكثف وغير فعالة جداً1. أساليب الفيروسية، على الرغم من كفاءة، ترتبط بمشاكل اندماج الفيروس وتوموريجينيسيتي2،،من34. في هذه المخطوطة، نحن تقرير استخدام هيولى سينداي الفيروس لإيصال إعادة برمجة العوامل وإنشاء خطوط خالية من البصمة اللجنة التوجيهية التي تفتقر إلى التكامل من أي تسلسل النواقل الفيروسية في جينومات على5. سينداي الفيروسات هو فيروس الحمض النووي الريبي التي هي تضعف خارج الخلية السيتوبلازم ~ 10 مقاطع بعد الإصابة وتنتج عوامل إعادة برمجة في وفرة، مما يؤدي إلى سرعة وكفاءة إعادة برمجة6،7. يمكن ثم انتقلت إيبسكس المنشأة إلى متوسط خالية من التغذية لتجنب استخدام الماوس الخلايا الليفية الجنينية (ميفس) كتغذية الخلايا8سهولة.
في هذا المنشور، بالإضافة إلى تحديد الفيروس سينداي بوساطة إعادة برمجة، يصف لنا أيضا بروتوكولا محسنة لتحرير إيبسكس، الذي لديه القدرة على إمداد الخلايا البشرية غير محدود مع التعديلات الوراثية المطلوبة للبحث. وقد استخدمنا التكنولوجيا كريسبر/Cas9 لتعديل إيبسكس، الذي يستخدم الآن لمجموعة واسعة من التطبيقات بما في ذلك ضرب الإضافية والضربة القاضية، والحذف الجينوم واسعة النطاق، مكتبة المجمعة الفحص لاكتشاف الجينات، الهندسة الوراثية العديد من الكائنات الحية النموذجية، والجينات العلاج9،،من1011. هذا الأسلوب ينطوي على تشكيل مجمعات العقدية المقيّحة-المتأتية Cas9 nuclease و 20-مير دليل الكشف أن تحقيق الاعتراف المستهدفة عن طريق قاعدة الاقتران مع تسلسل الجينوم الهدف المجاورة المتاخمة النوكليوتيدات بروتوسباسير 3 ‘ تسلسل عزر (بام). نوكلياسي Cas9 يدفع النيوكليوتيدات كسر الذين تقطعت بهم السبل مزدوجة ~ 3 من الموقع بام، الذي تم إصلاحه بعد ذلك غالباً بنهاية غير المتجانسة الانضمام إلى مسار (نهيج) مما يؤدي إلى عمليات الإدراج أو الحذف في إطار القراءة المفتوحة، والوظيفية مما خروج المغلوب من الجينات12.
لدينا بروتوكول تحسين يتضمن التفاصيل للثقافة البشرية خلايا البنكرياس، برمجة على ميتوتيكالي إبطال الماوس الخلايا الليفية الجنينية (ميفس) لتحقيق كفاءة أعلى لإعادة برمجة، التكيف اللاحقة إلى ثقافة خالية من علبة التغذية بالورق في ماتريجيل، وصف إيبسكس المنشأة، تسترشد كريسبر تصميم الحمض النووي الريبي والتحضير، وإيصالها إلى إيبسكس كمجمعات رنب وحيد الخلية الفرز لتوليد خطوط الاستنساخ من المحرر إيبسكس وسهلة الفحص وتحديد عمليات التحرير، ووصف استنساخ خلية مفردة. الحذف الجينوم تم إنشاؤها بكفاءة في هذه الدراسة بالأخذ بالبروتين Cas9 وهما كريسبر سجرنا رنب مجمعات للحث على فواصل الذين تقطعت بهم السبل مزدوجة (دسبس) والجزء الحذف التدخل. يستغل هذا الأسلوب استخدام دليلين لتوليد عمليات الحذف في إطار القراءة المفتوحة، وكفاءة عالية نهيج مما أدى إلى انخفاض عدد استنساخ هذا ضرورة أن تتسم، ومن السهل فرز أولى من الحيوانات المستنسخة بشعري الآلي وحدة التفريد، محلل يفتت. قريبا ستصبح هذه الجينوم فعالة تحرير طرق لتوليد نماذج الأمراض البشرية القائمة على الخلايا الجذعية نهج موحد والروتينية في أي مختبر الخلايا الجذعية. وأخيراً، تحرير الجينوم الدقيقة سيجعل من الممكن تذهب إلى أبعد من الخلايا الجذعية مرض النمذجة ومحتملة يمكن أن تساعد في تحفيز العلاجات المستندة إلى الخلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
إعادة برمجة الخلايا الجسدية البشرية إلى إيبسكس قدم دفعة كبيرة في ميادين البيولوجيا البحوث الأساسية والنمذجة المرض، وتطوير العقاقير والطب يشخص الطب التجديدي16. العديد من الأساليب الحالية والمستخدمة على نطاق واسع من جيل اللجنة التوجيهية البشرية تتطلب استخدام الفيروس مع مخاط?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيده عمل في المختبر منح زمالات ما بعد الدكتوراه للدكتورة انجالي ناندال، ومنحة الاستكشافية من “صندوق أبحاث الخلايا الجذعية ميريلاند” إلى “بريتيش تيليكوم” (تيدكو).
Materials
| Sendai viral vectors – CytoTune-iPS 2.0 Kit | Invitrogen | A16517 | Thaw on ice; S No: 1 |
| Trypsin EDTA | Gibco Life Tech | 25300-054 | 0.05%, 100 ml; S No: 2 |
| Rock inhibitor (Y-27632) | Milipore | SCM075 | Use 10 μM; S No: 3 |
| DMEM/F-12 medium | Invitrogen | 11330-032 | S No: 4 |
| Serum replacement (KSR) | Gibco | 10828028 | S No: 5 |
| DMEM | Invitrogen | 11960069 | 1X; S No: 6 |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific | SH30071.03 | Aliquot; S No: 7 |
| L-glutamine (Glutamax, 100X), liquid | Thermo Scientific | 35050061 | 1/100; S No: 8 |
| Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | 1/100; S No: 9 |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | 55 mM, 1/1,000; S No: 10 |
| Hausser Hemacytometers | Hausser Scientific | 02-671-54 | S No: 11 |
| 0.1% Gelatin Solution | STEMCELL Technologies | 7903 | Incubate at 37º C for 1 hour; S No: 12 |
| SSEA-4 antibody | Santacruz | sc-21704 | 1/100; S No: 13 |
| TRA-1-81 antibody | Cell Signaling | 4745S | 1/200; S No: 14 |
| OCT4 antibody | Santa Cruz | sc-5279 | 1/1,000; S No: 15 |
| Collagen I, Rat Tail | Life Technologies | A10483-01 | Keep cold; S No: 16 |
| Alexa Fluor fluorescent 488/ 568 (secondary antibodies) | Invitrogen | A21202/A10042 | 1/2,000; S No: 17 |
| DPBS | Hyclone | SH30028LS | 1X; S No: 18 |
| 100-mm tissue culture dish | Falcon | 353003 | S No: 20 |
| 96-well tissue culture plate | Falcon | 353078 | S No: 21 |
| 6-well tissue culture plate | Falcon | 353046 | S No: 22 |
| Dissecting scope | Nikon | SMZ745 | S No: 23 |
| Picking hood | NuAire | NU-301 | S No: 24 |
| 15 ml Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 188271 | S No: 25 |
| 50 ml Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 227261 | S No: 26 |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360 | S No: 28 |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | S No: 29 |
| Prigrow III medium | ABM | TM003 | S No: 31 |
| Countess™ Cell Counter | Invitrogen | C10227 | S No: 32 |
| Faxitron X-ray system | Faxitron | CellRad | S No: 33 |
| Accutase | Innovative cell Technologies | AT-104 | S No: 34 |
| Collagenase | Life Technologies | 17104019 | 1mg/ml stock; S No: 35 |
| Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | S No: 36 |
| hESC qualified matrigel | BD Biosciences | 354277 | To dilute, use cold DMEM/F-12; S No: 37 |
| bFGF | R & D | 233-FB | Stock 10 ug/ml; S No: 38 |
| Paraformaldehyde | EMS | 15710 | 4% stock in PBS; S No: 39 |
| TRA-1-60 | Santa Cruz | sc-21705 | 1/100; S No: 40 |
| NANOG | ReproCELL | RCAB0004P-F | 1/100; S No: 41 |
| Tween 20 | Sigma | P9416-100ML | S No: 42 |
| Alkaline Phosphatase kit | Stemgent | 00-0055 | S No: 43 |
| Cas9 protein | PNA Bio | CP01-50 | Thaw and aliquot; S No: 44 |
| Goat or donkey serum | Sigma | D9663/G9023 | S No: 45 |
| Triton X-100 | Sigma | X100-100ML | S No: 46 |
| DAPI | Thermo Scientific | D1306 | S No: 47 |
| Tris | Sigma | 9285-100ML | S No: 48 |
| NaCL | Sigma | S7653-250G | S No: 49 |
| EDTA | Sigma | BP2482-500 | S No: 50 |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202T | S No: 51 |
| Mega Shortscript T7 kit | Thermo Scientific | AM1354 | S No: 52 |
| Mega Clear kit | Thermo Scientific | AM1908 | S No: 53 |
| SMC4 | BD Biosciences | 354357 | S No: 54 |
| Fibronectin | STEMCELL Technologies | 7159 | S No: 55 |
| CloneJET cloning kit | Thermo Scientific | K1232 | S No: 56 |
| Fragment analyzerTM | Advanced Analytical | S No: 57 | |
| mTeSR1 medium kit | STEMCELL Technologies | 5850 | Warm to room temperature; S No: 58 |
| Freezing medium mFreSR™ | STEMCELL Technologies | 5855 | S No: 59 |
| Freezing medium CryoStor® | STEMCELL Technologies | 7930 | S No: 60 |
| MEFs | Globalstem | GSC-6301G | S No: 61 |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | S No: 62 |
| Human pancreatic cells | ABM | T0159 | S No: 63 |
| STEMdiff™ Neural Induction Medium | Stemcell Technologies | 5835 | S No: 64 |
| RPMI | Thermofisher | 11875-093 | S No: 65 |
| 2% B27-insulin | Thermofisher | A1895601 | S No: 66 |
| CHIR99021 | Stemcell Technologies | 72052 | S No: 67 |
| IWP4 | Stemcell Technologies | 72552 | S No: 68 |
| 2% B27 | Thermofisher | 17504044 | S No: 69 |
| MCDB 131 | Life Technologies | 10372019 | S No: 70 |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S8761-100ML | S No: 71 |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | S No: 72 |
| BSA | Proliant | 68700 | S No: 73 |
| GDF8 | Pepro-Tech | 120-00 | S No: 74 |
| TUJ1 antibody | EMD Milipore | AB9354 | S No: 75 |
| NKX2-5 antibody | Santa Cruz | Sc-14033 | S No: 76 |
| SOX17 antibody | R & D systems | AF1924 | S No: 77 |
| Propidium iodide | Thermo Scientific | P3566 | S No: 78 |
| Amaxa 4D-nucleofector™ | Lonza | AAF-1002 | S No: 79 |
| FACSAria II (cell sorter) | BD biosciences | SORP UV | S No: 80 |
Referências
- Malik, N., Rao, M. S. A review of the methods for human iPSC derivation. Methods Mol. Biol. 997, 23-33 (2013).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Sommer, C. A., et al. Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette. Stem cells. 27, 543-549 (2009).
- Macarthur, C. C., et al. Generation of human-induced pluripotent stem cells by a nonintegrating RNA Sendai virus vector in feeder-free or xeno-free conditions. Stem cells Int. , 564612 (2012).
- Li, H. O., et al. A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression. J Virol. 74, 6564-6569 (2000).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc. Jpn. Acad. Ser. B, PhysBiol. Sci. 85, 348-362 (2009).
- Nakagawa, M., et al. A novel efficient feeder-free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells. Sci. Rep. 4, 3594 (2014).
- Hockemeyer, D., Jaenisch, R. Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing. Cell stem cell. 18, 573-586 (2016).
- Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes. Cell. 169, 559 (2017).
- Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes. Cell. 168, 20-36 (2017).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat. Biotech. 32, 347-355 (2014).
- McElroy, S. L., Reijo Pera, R. A. Preparation of mouse embryonic fibroblast feeder cells for human embryonic stem cell culture. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, E1848-E1857 (2012).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nat. Biotech. 32, 1121-1133 (2014).
- Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nat. Rev. Drug Discov. 16, 115-130 (2017).
- Wang, B., et al. Highly efficient CRISPR/HDR-mediated knock-in for mouse embryonic stem cells and zygotes. BioTechniques. 59, (2015).
- Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA. J Biotech. 241, 136-146 (2017).
