Efficiente generazione e la modifica di IPSCs privo di alimentatore da cellule pancreatiche umane utilizzando il sistema di CRISPR-Cas9
Summary
Questo protocollo descrive in dettaglio la generazione di cellule staminali pluripotenti indotte privo di impronta (iPSCs) da cellule pancreatiche umane in condizioni prive di alimentatore, seguito da editing con CRISPR/Cas9 ribonucleoproteine e caratterizzazione del modificati cloni unicellulari.
Abstract
Cellule staminali pluripotenti embrionali e indotto può auto-rinnovarsi e differenziarsi in più tipi di cellule del corpo. Le cellule pluripotenti sono così ambite per la ricerca in medicina rigenerativa e sono attualmente nei test clinici per le malattie dell’occhio, diabete, malattie cardiache e altri disturbi. La capacità di differenziarsi in tipi cellulari specializzati accoppiati con i recenti progressi nel genoma tecnologie compreso il sistema CRISPR/Cas hanno fornito ulteriori opportunità per la sartoria il genoma di iPSC per svariate applicazioni compreso la malattia di modellazione, terapia genica e la differenziazione dei percorsi di differenziazione, per citarne alcuni. Tra le tecnologie di modifica disponibili, il CRISPR/Cas9 da Streptococcus pyogenes è emerso come uno strumento di scelta per l’editing site-specific del genoma eucariotico. Il CRISPRs sono facilmente accessibile, economico e altamente efficiente in ingegneria modifiche mirate. Il sistema richiede una nucleasi Cas9 e una sequenza di guida (20-mer) specifica per la destinazione genomica adiacente con un 3-nucleotide “NGG” protospacer-adiacente-motivo (PAM) per il targeting Cas9 al locus genomico desiderato, a fianco di un tracciante universale di associazione Cas9 (RNA insieme chiamato RNA guida singola o sgRNA). Qui vi presentiamo un passo-passo il protocollo per generazione efficiente di iPSC alimentatore indipendente e privo di impronta e descrivere metodologie per l’editing genomico di iPSC utilizzando i complessi della ribonucleoproteina (RNP) Cas9. Il genoma protocollo di modifica è efficace e può essere facilmente multiplexed di sgRNAs pre-complessanti per più di una destinazione con la proteina Cas9 e contemporaneamente fornire nelle cellule. Infine, descriviamo un approccio semplificato per l’identificazione e caratterizzazione di iPSCs con modifiche desiderate. Presi insieme, le strategie descritte dovrebbero semplificare la generazione e la modifica di iPSC per molteplici applicazioni.
Introduction
La riprogrammazione di cellule somatiche umane allo stato pluripotent da sovraespressione di fattori di riprogrammazione ha rivoluzionato la ricerca sulle cellule staminali con applicazioni nella modellazione di malattia, la medicina rigenerativa e lo sviluppo di farmaci. Sono disponibili per la consegna dei fattori di riprogrammazione e generando iPSCs diversi metodi di riprogrammazione non-virale, ma il processo è lavoro intensivo e non molto efficiente1. I metodi virali, anche se efficiente, sono associati a problemi di integrazione del virus e carcinogenicità2,3,4. In questo manoscritto, segnaliamo l’uso di citoplasmico Sendai virus per fornire fattori di riprogrammazione e stabilire linee di iPSC privo di impronta che la mancanza di integrazione di tutte le sequenze di vettori virali in loro genomi5. Sendai virus è un virus a RNA che è diluito su passaggi di citoplasma ~ 10 cella dopo l’infezione e produce fattori di riprogrammazione in abbondanza, portando a rapida ed efficiente riprogrammazione6,7. Le iPSCs stabilito poi può essere aumentato facilmente al medium senza alimentatore per evitare l’uso di fibroblasti embrionali del mouse (MEFs) come alimentatore cellule8.
In questa pubblicazione, oltre a delineare il virus Sendai mediato riprogrammazione, descriviamo anche un protocollo migliorato per l’editing iPSCs, che ha il potenziale per la fornitura di cellule umane illimitate con modificazioni genetiche desiderate per la ricerca. Abbiamo utilizzato la tecnologia CRISPR/Cas9 per la modifica delle iPSCs, che ora viene utilizzato per una vasta gamma di applicazioni tra cui bussare-ins e Ko, delezioni genomiche su larga scala, libreria in pool di screening per l’individuazione del gene, ingegneria genetica di numerosi organismi di modello e gene terapia9,10,11. Questa tecnica comporta la formazione di complessi di Streptococcus pyogenes-derivata Cas9 nucleasi e 20-mer guida RNAs che ottenere il riconoscimento di destinazione tramite appaiamento con sequenza genomica target adiacente al 3′ del nucleotide protospacer adiacente sequenza di motivo (PAM). Le nucleasi Cas9 induce un nucleotidi doppia interruzione incagliato ~ 3 dal sito PAM, che è successivamente riparato prevalentemente da non-omologo fine entrare via (NHEJ) che conduce gli inserimenti o eliminazioni nell’open reading frame e quindi funzionale Ko di geni12.
Il nostro protocollo migliorato include i dettagli per la coltura di cellule pancreatiche umane, loro riprogrammazione su mitotically inattivato fibroblasti embrionali del mouse (MEFs) per raggiungere una maggiore efficienza della riprogrammazione, successivo adattamento alla cultura senza alimentatore il Matrigel, caratterizzazione delle iPSCs stabilito, CRISPR guidato RNA progettazione e preparazione, consegna in iPSCs come complessi di RNP, singola cella ordinamento per generare linee clonali di iPSCs modificato, facile screening e identificazione di modifiche e la caratterizzazione di singola cella cloni. Delezioni genomiche in modo efficiente sono stati generati in questo studio tramite l’introduzione di proteine Cas9 e due CRISPR sgRNA RNP complessi per indurre interruzioni incagliate doppie (DSBs) e l’eliminazione dell’intervento del segmento. Questo metodo sfrutta l’uso di due guide per la generazione le eliminazioni nell’open reading frame, ad alta efficienza di NHEJ portando a basso numero di cloni che necessità di essere caratterizzato e facile screening preliminare di cloni di capillare automatizzata unità di elettroforesi, analizzatore di frammento. Questi genoma efficaci metodi per generare modelli di malattia umana basata su cellule staminali di editing diventerà presto un approccio standard e di routine in qualsiasi laboratorio di cellule staminali. Infine, editing genomico preciso renderà possibile andare di là di modellazione di malattia delle cellule staminali e potenzialmente potrebbe contribuire a catalizzare le terapie basate sulle cellule.
Protocol
Representative Results
Discussion
Riprogrammazione di cellule somatiche umane per iPSCs ha fornito una spinta importante ai campi di ricerca di base di biologia, medicina personalizzata, modellazione di malattia, lo sviluppo di farmaci e medicina rigenerativa16. Molti metodi attuali e ampiamente usati di iPSC umana generazione richiedono l’uso di virus con il rischio di integrazione nel genoma ospite o episomal vettori con bassa efficienza di riprogrammazione. Qui, presentiamo un metodo efficiente per la generazione iPSCs privo di…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Lavoro in laboratorio è stato sostenuto da postdoctoral fellowship grant a Dr. Anjali Nandal e grant esplorativo da Maryland Stem Cell Research Fund a BT (TEDCO).
Materials
| Sendai viral vectors – CytoTune-iPS 2.0 Kit | Invitrogen | A16517 | Thaw on ice; S No: 1 |
| Trypsin EDTA | Gibco Life Tech | 25300-054 | 0.05%, 100 ml; S No: 2 |
| Rock inhibitor (Y-27632) | Milipore | SCM075 | Use 10 μM; S No: 3 |
| DMEM/F-12 medium | Invitrogen | 11330-032 | S No: 4 |
| Serum replacement (KSR) | Gibco | 10828028 | S No: 5 |
| DMEM | Invitrogen | 11960069 | 1X; S No: 6 |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific | SH30071.03 | Aliquot; S No: 7 |
| L-glutamine (Glutamax, 100X), liquid | Thermo Scientific | 35050061 | 1/100; S No: 8 |
| Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | 1/100; S No: 9 |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | 55 mM, 1/1,000; S No: 10 |
| Hausser Hemacytometers | Hausser Scientific | 02-671-54 | S No: 11 |
| 0.1% Gelatin Solution | STEMCELL Technologies | 7903 | Incubate at 37º C for 1 hour; S No: 12 |
| SSEA-4 antibody | Santacruz | sc-21704 | 1/100; S No: 13 |
| TRA-1-81 antibody | Cell Signaling | 4745S | 1/200; S No: 14 |
| OCT4 antibody | Santa Cruz | sc-5279 | 1/1,000; S No: 15 |
| Collagen I, Rat Tail | Life Technologies | A10483-01 | Keep cold; S No: 16 |
| Alexa Fluor fluorescent 488/ 568 (secondary antibodies) | Invitrogen | A21202/A10042 | 1/2,000; S No: 17 |
| DPBS | Hyclone | SH30028LS | 1X; S No: 18 |
| 100-mm tissue culture dish | Falcon | 353003 | S No: 20 |
| 96-well tissue culture plate | Falcon | 353078 | S No: 21 |
| 6-well tissue culture plate | Falcon | 353046 | S No: 22 |
| Dissecting scope | Nikon | SMZ745 | S No: 23 |
| Picking hood | NuAire | NU-301 | S No: 24 |
| 15 ml Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 188271 | S No: 25 |
| 50 ml Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 227261 | S No: 26 |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360 | S No: 28 |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | S No: 29 |
| Prigrow III medium | ABM | TM003 | S No: 31 |
| Countess™ Cell Counter | Invitrogen | C10227 | S No: 32 |
| Faxitron X-ray system | Faxitron | CellRad | S No: 33 |
| Accutase | Innovative cell Technologies | AT-104 | S No: 34 |
| Collagenase | Life Technologies | 17104019 | 1mg/ml stock; S No: 35 |
| Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | S No: 36 |
| hESC qualified matrigel | BD Biosciences | 354277 | To dilute, use cold DMEM/F-12; S No: 37 |
| bFGF | R & D | 233-FB | Stock 10 ug/ml; S No: 38 |
| Paraformaldehyde | EMS | 15710 | 4% stock in PBS; S No: 39 |
| TRA-1-60 | Santa Cruz | sc-21705 | 1/100; S No: 40 |
| NANOG | ReproCELL | RCAB0004P-F | 1/100; S No: 41 |
| Tween 20 | Sigma | P9416-100ML | S No: 42 |
| Alkaline Phosphatase kit | Stemgent | 00-0055 | S No: 43 |
| Cas9 protein | PNA Bio | CP01-50 | Thaw and aliquot; S No: 44 |
| Goat or donkey serum | Sigma | D9663/G9023 | S No: 45 |
| Triton X-100 | Sigma | X100-100ML | S No: 46 |
| DAPI | Thermo Scientific | D1306 | S No: 47 |
| Tris | Sigma | 9285-100ML | S No: 48 |
| NaCL | Sigma | S7653-250G | S No: 49 |
| EDTA | Sigma | BP2482-500 | S No: 50 |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202T | S No: 51 |
| Mega Shortscript T7 kit | Thermo Scientific | AM1354 | S No: 52 |
| Mega Clear kit | Thermo Scientific | AM1908 | S No: 53 |
| SMC4 | BD Biosciences | 354357 | S No: 54 |
| Fibronectin | STEMCELL Technologies | 7159 | S No: 55 |
| CloneJET cloning kit | Thermo Scientific | K1232 | S No: 56 |
| Fragment analyzerTM | Advanced Analytical | S No: 57 | |
| mTeSR1 medium kit | STEMCELL Technologies | 5850 | Warm to room temperature; S No: 58 |
| Freezing medium mFreSR™ | STEMCELL Technologies | 5855 | S No: 59 |
| Freezing medium CryoStor® | STEMCELL Technologies | 7930 | S No: 60 |
| MEFs | Globalstem | GSC-6301G | S No: 61 |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | S No: 62 |
| Human pancreatic cells | ABM | T0159 | S No: 63 |
| STEMdiff™ Neural Induction Medium | Stemcell Technologies | 5835 | S No: 64 |
| RPMI | Thermofisher | 11875-093 | S No: 65 |
| 2% B27-insulin | Thermofisher | A1895601 | S No: 66 |
| CHIR99021 | Stemcell Technologies | 72052 | S No: 67 |
| IWP4 | Stemcell Technologies | 72552 | S No: 68 |
| 2% B27 | Thermofisher | 17504044 | S No: 69 |
| MCDB 131 | Life Technologies | 10372019 | S No: 70 |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S8761-100ML | S No: 71 |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | S No: 72 |
| BSA | Proliant | 68700 | S No: 73 |
| GDF8 | Pepro-Tech | 120-00 | S No: 74 |
| TUJ1 antibody | EMD Milipore | AB9354 | S No: 75 |
| NKX2-5 antibody | Santa Cruz | Sc-14033 | S No: 76 |
| SOX17 antibody | R & D systems | AF1924 | S No: 77 |
| Propidium iodide | Thermo Scientific | P3566 | S No: 78 |
| Amaxa 4D-nucleofector™ | Lonza | AAF-1002 | S No: 79 |
| FACSAria II (cell sorter) | BD biosciences | SORP UV | S No: 80 |
Referências
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