Zuivering van viraal DNA voor de identificatie van geassocieerde virale en cellulaire eiwitten
Summary
Het doel van dit protocol is te specifiek tag en selectief isoleren viraal DNA van geïnfecteerde cellen voor de karakterisatie van het virale genoom geassocieerde eiwitten.
Abstract
Het doel van dit protocol is te isoleren van herpes simplex virustype 1 (HSV-1) DNA van geïnfecteerde cellen voor de identificatie van geassocieerde virale en cellulaire eiwitten door massaspectrometrie. Hoewel eiwitten die met virale genoom samenwerken belangrijke rol spelen bij de bepaling van het resultaat van een infectie, was een uitgebreide analyse van het virale genoom geassocieerde eiwitten niet eerder mogelijk. Hier tonen we een methode waarmee de directe zuivering van HSV-1 genomen van geïnfecteerde cellen. Repliceren viraal DNA heet selectief met gemodificeerde nucleotiden die een alkyn functionele groep bevatten. Gelabelde DNA is vervolgens specifiek en onherroepelijk gelabeld via de covalente bevestiging van biotine azide via een koper (I)-gekatalyseerde azide-alkyn cycloadditie of klik op reactie. Biotine-gelabeld DNA wordt gezuiverd op daar beklede kralen en geassocieerde eiwitten zijn geëlueerd en geïdentificeerd door massaspectrometrie. Deze methode maakt het mogelijk selectief richten en isolatie van HSV-1 replicatie vorken of hele genoom van complexe biologische omgevingen. Aanpassing van deze aanpak zal bovendien zorgen voor het onderzoek van verschillende aspecten van herpesviral infectie, evenals het onderzoek van het genoom van andere DNA-virussen.
Introduction
Virussen hebben een beperkte capaciteit om essentiële functies vervullen en dus afhankelijk van gastheer factoren om kritieke aspecten van infectie met inbegrip van virale genexpressie, replicatie, reparatie, recombinatie en vervoer. De activiteiten van deze host factoren zijn vaak aangevuld met viraal gecodeerde eiwitten. Daarnaast moeten virussen opsporen en interferentie voorkomen door cellulaire reacties op virale infectie. Daarom, virus-gastheer interacties dicteren de uitkomst van de infectie. Van het allergrootste belang is het begrijpen hoe virussen veranderen de cellulaire omgeving aan te passen van de cellulaire machines om virale processen. Van bijzonder belang is het identificeren welke factoren en processen op virale genoom gedurende de besmettelijke cyclus handelen.
Herpes simplex virustype 1 (HSV-1) is dat een double strandde DNA-virus dat een aanzienlijk deel van de menselijke bevolking infecteert. Binnen het eerste uur van infectie treedt het virale genoom de kern, waar een geordende opeenvolging van virale genexpressie ensues in coördinatie met virale replicatie van het DNA (vDNA)1. In de kern, genomes gelden Epigenetische regulatie, reparatie en recombinatie ondergaan en worden verpakt in capsids, zodanig dat de eerste nakomelingen virionen worden geproduceerd binnen minder dan zes uur. De uitgebreide evaluatie van het virale genoom geassocieerde eiwitten in de loop van de infectie zal leggen de basis voor het onderzoek naar de moleculaire details van processen die handelen op virale genoom, en geven inzicht in welke virale en cellulaire factoren zijn betrokken in verschillende stadia van de infectie.
Vorige methoden voor het onderzoek van gastheer factoren die betrokken zijn bij virale infectie zijn affiniteit zuivering van virale eiwitten voor de analyse van de bijbehorende cellulaire eiwitten2,,3,,4,5 , 6 , 7 , 8 , 9. deze testen zijn instrumentale voor de identificatie van cellulaire factoren die betrokken zijn in host antivirale reacties, evenals virale chromatin wijziging, genexpressie, en DNA herstellen. Het is echter moeilijk om na te gaan of interacties afhankelijk zijn van de associatie met vDNA, en proteomics alleen bieden inzicht in interacties die als een functie van een specifieke virale factor plaatsvinden. Chromatine immunoprecipitation (ChIP) is gebruikt om te bepalen waar specifieke virale en cellulaire proteïnen binden aan virale genoom10,11,12,13,14 , 15 en Fluorescente kruising in situ (vissen) gecombineerd met immunocytochemie heeft de visualisatie van cellulaire factoren die colocalize met vDNA16,17,18, 19 , 20. deze gehaltebepalingen toestaan voor ruimtelijke en temporele analyse. Beperkingen bevatten echter de behoefte aan zeer specifieke antilichamen, beperkte gevoeligheid, en de noodzaak voor vorige inzicht in virus-gastheer interacties. Daarom ontwikkelden we een methode gebaseerd op de iPOND (isolatie van proteïnen op ontluikende DNA)21 en aniPOND (versnelde native iPOND)22 te selectief label en te zuiveren van vDNA van geïnfecteerde cellen voor de onbevooroordeelde identificatie van virale genoom geassocieerde eiwitten door massaspectrometrie. iPOND behulpzaam voor het onderzoek van cellulaire replicatie vork dynamiek geweest.
Voor de selectieve zuivering van het virale genoom van geïnfecteerde cellen, met ethynyl bewerkt nucleosiden, 5-ethynyl-2´-deoxyuridine (EdU) of 5-ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC) (Figuur 1), gevolgd door covalente repliceren vDNA heet vervoeging aan biotine azide via Klik op chemie om één stap zuivering van het virale genoom en geassocieerde eiwitten op daar beklede kralen (figuur 2B). Bovenal worden infecties uitgevoerd in stationaire cellen, die niet met cellulaire DNA-replicatie bezighouden zich om specifieke etikettering van vDNA. Bovendien, HSV-1 infectie veroorzaakt celcyclus arrestatie en remt cellulaire DNA replicatie23,24. Virus kan worden prelabeled voordat de infectie voor de analyse van eiwitten die zijn gekoppeld aan binnenkomende virale genoom (figuur 1A) of label tijdens de replicatie van DNA voor de analyse van eiwitten die zijn gekoppeld aan nieuw samengestelde vDNA (figuur 1B) 25. Bovendien pulse chase analyse kan worden gebruikt om te onderzoeken van de aard van de eiwitten verbonden met de virale replicatie vorken (Figuur 1 c)26. Daarnaast kan ethynyl gemodificeerde vDNA covalent zijn geconjugeerd met een fluorophore voor ruimtelijke onderzoek van eiwit dynamiek (figuur 2A pt Figuur 3). Imaging zorgt voor de directe visualisatie van vDNA is een gratis benadering voor de validatie van vDNA-eiwit interacties en kan worden aangepast aan het virale genoom gedurende infectie bijhouden. Wij verwachten dat deze aanpak verder kunnen worden gewijzigd om te studeren van enig aspect van herpesviral besmetting, met inbegrip van latentie en reactivering, en te bestuderen of andere DNA-virussen. Bovendien, labelen met 5-ethynyl uridine (EU) voor de analyse van het virale genoom RNA kan leiden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol omvat meerdere stappen die, indien niet zorgvuldig gevolgd in aanzienlijk verlaagd eiwit opbrengst of verontreiniging met cellulaire DNA resulteren kunnen. Het is essentieel dat de stationaire cellen om ervoor te zorgen dat de cellulaire DNA niet is gelabeld en gezuiverd voor alle experimenten worden gebruikt. Dit kan worden bevestigd door het ontbreken van cellulaire DNA-polymerase in de eiwitSteekproef omdat HSV-1 geen gebruik van cellulaire DNA-polymerase voor genoom-synthese. Tijdens EdC labeling en kern…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij erkennen Hannah Fox voor hulp bij de voorbereiding van dit manuscript. Dit werk werd gesteund door de NIH R01AI030612 verlenen.
Materials
| MRC-5 cells | ATCC | CCL-171 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-179 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12800-082 | substituted with 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 12 mM (for growth in flasks) or 30 mM (for growth in dishes) sodium-bicarbinate |
| 600 cm2 tissue culture dish | Thermo Fisher Scientific | 166508 | |
| Tris Buffered Saline (TBS), pH 7.4 | 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25.1 mM Tricine | ||
| HSV-1 stock | stocks with titers greater than 1×109 PFU/mL work best | ||
| Sephadex G-25 column (PD-10 Desalting Column) | GE Healthcare | 17085101 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-1 | |
| 5´-Ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC) | Sigma-Aldrich | T511307 | Dissolve in DMSO to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C |
| 2´-deoxycytidine (deoxyC) | Sigma-Aldrich | D3897 | Dissolve in water to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C |
| Nuclear Extraction Buffer (NEB) | prepare fresh (20 mM Hepes pH 7.2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 300 mM Sucrose, 0.5% Igepal) | ||
| Cell scraper | Bellco glass | 7731-22000 | Autoclave before use |
| Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| PBS, pH 7.2 (10x) | 1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4 (dilute to 1x in sterile water before use) | ||
| Copper (II) sulfate pentahydrate (CuSO4-5H2O) | Fisher Scientific | C489 | Prepare 100 mM stock and store at 4 °C for up to 1 month |
| (+) Sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | Freshly prepare 100 mM stock and store on ice until use |
| Biotin azide | Invitrogen | B10184 | Prepare 10 mM stock in DMSO, aliquot, and store at -20 °C for up to 1 year |
| Click Reaction Mix | prepare immediately before use by adding reagents in the indicated order (10 mL: 8.8 mL 1x PBS, 200 mL 100 mM CuSO4, 25mL 10 mM Biotin Azide, 1 mL 100 mM sodium ascorbate) | ||
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | Dissolve in 1 mL water to prepare 50x stock, can store at 4 °C for up to 1 week, or directly add 1 pill to 50 mL buffer |
| freezing buffer | prepare fresh (7 mL 100% glycerol, 3 mL NEB, 200 μL 50x protease inhibitor) | ||
| Buffer B1 | prepare fresh (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, 1x protease inhibitor) | ||
| Buffer B2 | prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0.5% Igepal, 1x protease inhibitor) | ||
| Buffer B3 | prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1x protease inhibitor) | ||
| Vibra Cell Ultra Sonic Processer equipped with a 3 mm microtip probe | Sonics | VCX 130 | |
| Cell strainer | Falcon | 352360 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Life Technologies | 65601 | |
| DynaMag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | |
| Mini-Tube Rotator | Fisher Scientific | 260750F | |
| 2X Laemmli sample buffer | Mix 400 mg of SDS, 2 mL 100% glycerol, 1.25 mL of 1 M Tris (pH 6.8), and 10 mg of bromophenol blue in 8 mL water. Store at 4 °C for up to 6 months. Before use add 1 M DTT to a final concentration of 200 mM. | ||
| cap locks for 1.5 mL tube | Fisher Scientific | NC9679153 | |
| Standard western blotting reagents | |||
| NOVEX Colloidal Blue Staining Kit | Invitrogen | LC6025 | |
| 12-well tissue culture dish | Corning | 3513 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-100 | Autoclave before use |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-552-5 | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | dilute to 3.7% in 1x PBS before use |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605 | prepare 3% in 1x PBS |
| Permeabilization buffer (0.5% Triton-X 100) | Sigma-Aldrich | T8787 | prepare 0.5% Triton-X 100 in 1x PBS |
| Click reaction cocktail – Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit | Molecular Probes | C10337 | prepare according to manufactorer's protocol |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H1399 | prepare 10 mg/mL in water, can store at 4 °C for up to 1 year |
| mouse anti-ICP8 primary antibody | Abcam | ab20194 | Use a 1:200 dilution in 1x PBS |
| mouse anti-UL42 primary antibody (2H4) | Abcam | ab19311 | Use a 1:200 dilution in 1x PBS |
| Goat anti-mouse 594-conjugated secondary antibody | Life Technologies | a11005 | Use a 1:500 dilution in 1x PBS |
| Immu-mount | Thermo Fisher Scientific | 9990402 | |
| 2x SDS-bicarb solution | 2% SDS, 200 mM NaHCO3 | ||
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | mix 25:24:1 at least 1 day before use, store at 4 °C in the dark | ||
| chloroform:isoamyl alcohol | mix 24:1 at least 1 day before use, store at room temperature in the dark | ||
| 10x Tris EDTA (TE), pH 8.0 | 100 mM Tris, 10 mM EDTA (dilute to 1x before use) | ||
| Qiaquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| 3 M sodium acetate pH 5.2 | |||
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | Q32866 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | |
| Qubit assay tubes | Invitrogen | Q32856 | |
| Fluorescence microscope equipped with imaging software | |||
| Microcentrifuge for 1.5 mL tubes | |||
| Tabletop centrifuge for 15 and 50 mL tubes | |||
| Cell culture incubator | |||
| Biosafety cabinet | |||
| Heat blocks | 65 °C and 95 °C |
Referências
- Knipe, D. M., Howley, P. M. . Fields virology. , (2013).
- Engel, E. A., Song, R., Koyuncu, O. O., Enquist, L. W. Investigating the biology of alpha herpesviruses with MS-based proteomics. Proteomics. 15, 1943-1956 (2015).
- Wagner, L. M., DeLuca, N. A. Temporal association of herpes simplex virus ICP4 with cellular complexes functioning at multiple steps in PolII transcription. PloS One. 8, e78242 (2013).
- Taylor, T. J., Knipe, D. M. Proteomics of herpes simplex virus replication compartments: association of cellular DNA replication, repair, recombination, and chromatin remodeling proteins with ICP8. J Virol. 78, 5856-5866 (2004).
- Fontaine-Rodriguez, E. C., Taylor, T. J., Olesky, M., Knipe, D. M. Proteomics of herpes simplex virus infected cell protein 27: association with translation initiation factors. Virology. 330, 487-492 (2004).
- Greco, T. M., Diner, B. A., Cristea, I. M. The Impact of Mass Spectrometry-Based Proteomics on Fundamental Discoveries in Virology. Annu Rev Virol. 1, 581-604 (2014).
- Conwell, S. E., White, A. E., Harper, J. W., Knipe, D. M. Identification of TRIM27 as a novel degradation target of herpes simplex virus 1 ICP0. J Virol. 89, 220-229 (2015).
- Suk, H., Knipe, D. M. Proteomic analysis of the herpes simplex virus 1 virion protein 16 transactivator protein in infected cells. Proteomics. 15, 1957-1967 (2015).
- Balasubramanian, N., Bai, P., Buchek, G., Korza, G., Weller, S. K. Physical interaction between the herpes simplex virus type 1 exonuclease, UL12, and the DNA double-strand break-sensing MRN complex. J Virol. 84, 12504-12514 (2010).
- Sampath, P., Deluca, N. A. Binding of ICP4, TATA-binding protein, and RNA polymerase II to herpes simplex virus type 1 immediate-early, early, and late promoters in virus-infected cells. J Virol. 82, 2339-2349 (2008).
- Amelio, A. L., McAnany, P. K., Bloom, D. C. A chromatin insulator-like element in the herpes simplex virus type 1 latency-associated transcript region binds CCCTC-binding factor and displays enhancer-blocking and silencing activities. J Virol. 80, 2358-2368 (2006).
- Cliffe, A. R., Knipe, D. M. Herpes simplex virus ICP0 promotes both histone removal and acetylation on viral DNA during lytic infection. J Virol. 82, 12030-12038 (2008).
- Herrera, F. J., Triezenberg, S. J. VP16-dependent association of chromatin-modifying coactivators and underrepresentation of histones at immediate-early gene promoters during herpes simplex virus infection. J Virol. 78, 9689-9696 (2004).
- Kent, J. R., et al. During lytic infection herpes simplex virus type 1 is associated with histones bearing modifications that correlate with active transcription. J Virol. 78, 10178-10186 (2004).
- Oh, J., Fraser, N. W. Temporal association of the herpes simplex virus genome with histone proteins during a lytic infection. J Virol. 82, 3530-3537 (2008).
- Catez, F., et al. HSV-1 genome subnuclear positioning and associations with host-cell PML-NBs and centromeres regulate LAT locus transcription during latency in neurons. PLoS Pathog. 8, e1002852 (2012).
- Everett, R. D., Murray, J., Orr, A., Preston, C. M. Herpes simplex virus type 1 genomes are associated with ND10 nuclear substructures in quiescently infected human fibroblasts. J Virol. 81, 10991-11004 (2007).
- Tang, Q., et al. Determination of minimum herpes simplex virus type 1 components necessary to localize transcriptionally active DNA to ND10. J Virol. 77, 5821-5828 (2003).
- Ishov, A. M., Maul, G. G. The periphery of nuclear domain 10 (ND10) as site of DNA virus deposition. J Cell Biol. 134, 815-826 (1996).
- Maroui, M. A., et al. Latency Entry of Herpes Simplex Virus 1 Is Determined by the Interaction of Its Genome with the Nuclear Environment. PLoS Pathog. 12, e1005834 (2016).
- Sirbu, B. M., Couch, F. B., Cortez, D. Monitoring the spatiotemporal dynamics of proteins at replication forks and in assembled chromatin using isolation of proteins on nascent DNA. Nat Protoc. 7, 594-605 (2012).
- Leung, K. H., Abou El Hassan, M., Bremner, R. A rapid and efficient method to purify proteins at replication forks under native conditions. BioTechniques. 55, 204-206 (2013).
- Hobbs, W. E., DeLuca, N. A. Perturbation of cell cycle progression and cellular gene expression as a function of herpes simplex virus ICP0. J Virol. 73, 8245-8255 (1999).
- Lomonte, P., Everett, R. D. Herpes simplex virus type 1 immediate-early protein Vmw110 inhibits progression of cells through mitosis and from G(1) into S phase of the cell cycle. J Virol. 73, 9456-9467 (1999).
- Dembowski, J. A., DeLuca, N. A. Selective recruitment of nuclear factors to productively replicating herpes simplex virus genomes. PLoS Pathog. 11, e1004939 (2015).
- Dembowski, J. A., Dremel, S. E., DeLuca, N. A. Replication-Coupled Recruitment of Viral and Cellular Factors to Herpes Simplex Virus Type 1 Replication Forks for the Maintenance and Expression of Viral Genomes. PLoS Pathog. 13, e1006166 (2017).
- Bjornberg, O., Nyman, P. O. The dUTPases from herpes simplex virus type 1 and mouse mammary tumour virus are less specific than the Escherichia coli enzyme. J Gen Virol. 77 (Pt 12), 3107-3111 (1996).
- Chiou, S. H. DNA- and protein-scission activities of ascorbate in the presence of copper ion and a copper-peptide complex. J Biochem. 94, 1259-1267 (1983).
- Kennedy, D. C., et al. Cellular consequences of copper complexes used to catalyze bioorthogonal click reactions. J Am Chem Soc. 133, 17993-18001 (2011).
- Snel, B., Lehmann, G., Bork, P., Huynen, M. A. STRING: a web-server to retrieve and display the repeatedly occurring neighbourhood of a gene. Nucleic Acids Res. 28, 3442-3444 (2000).
