Очистка вирусной ДНК для идентификации связанных вирусных и клеточных белков
Summary
Цель настоящего Протокола заключается в специально тег и выборочно изолировать вирусной ДНК от инфицированных клеток для характеризации вирусного генома связанных белков.
Abstract
Целью настоящего Протокола является изолировать вирус простого герпеса типа 1 (ВПГ-1) ДНК от инфицированных клеток для идентификации связанных вирусных и клеточных белков, Массовое спектрометрирование. Хотя белки, которые взаимодействуют с вирусных геномов играют важную роль в определении результатов инфекции, всесторонний анализ вирусного генома связанных белков нецелесообразно ранее. Здесь мы показываем, метод, который позволяет прямое очистки геномов HSV-1 от инфицированных клеток. Репликации вирусных ДНК выборочно помечены модифицированных нуклеотидов, которые содержат алкины функциональной группы. Приклеенные этикетку ДНК затем специально и необратимо маркирован через ковалентных вложение биотина азид через меди (I)-катализатором реакции циклоприсоединения или нажмите азид алкины. Биотин тегами ДНК очищается на стрептавидина покрытием бусины и связанные протеины этого eluted и определены по масс-спектрометрии. Этот метод позволяет избирательного отношения и изоляции HSV-1 репликации вилки или весь геном из сложных биологических сред. Кроме того адаптации этого подхода позволит для расследования различных аспектов герпетический инфекции, а также изучение геномов других ДНК вирусов.
Introduction
Вирусы имеют ограниченные возможности для выполнения основных функций и поэтому зависят от факторов хост для облегчения критических аспектов инфекции, включая экспрессии вирусных генов, репликации, ремонт, рекомбинации и транспорта. Деятельность этих факторов хост часто дополнены вирусно закодированные белков. Кроме того вирусы должны избежать обнаружения и вмешательства, клеточных реакций к вирусной инфекции. Таким образом вирус хост взаимодействия диктовать результаты инфекции. Первостепенное значение является понимание того, как вирусы изменяют клеточной среды адаптировать клеточными для облегчения вирусных процессов. Особый интерес является определение, какие факторы и процессы действуют на вирусных геномов инфекционных цикла.
Вирус простого герпеса типа 1 (ВПГ-1) — двойной многожильный ДНК вируса, который заражает значительную долю населения. В течение первого часа инфекции вирусного генома проникает в ядро, где упорядоченный Каскад экспрессии вирусных генов наступает в координации с вирусной репликации ДНК (vDNA)1. В ядре геномы подлежат эпигеномные регулирование, пройти ремонт и рекомбинации и упакованы в capsids, таким образом, что первый вирионы потомства производятся в течение менее шести часов. Всеобъемлющую оценку вирусного генома связанных белков на протяжении инфекции заложит основу для изучения молекулярных детали процессов, которые действуют на вирусных геномов и даст понимание вирусных и клеточные факторы участвуют в различных стадиях инфекции.
Предыдущие методы расследования принимающей факторов в вирусной инфекции включают очищение сродства вирусных белков для анализа связанных клеточных белков2,3,4,5 , 6 , 7 , 8 , 9. Эти анализы сыграли для выявления клеточных факторов в принимающих противовирусное ответы, а также модификация вирусный хроматина, экспрессии генов, и ремонт ДНК. Однако трудно определить ли взаимодействия зависят от ассоциации с vDNA, и протеомики только обеспечить понимание взаимодействия, которые происходят в зависимости от конкретного вирусного фактор. Иммунопреципитации Chromatin (обломока) был использован для определения, где конкретные вирусных и клеточных белков связывать вирусных геномов10,11,12,13,14 , 15 и флуоресцентной гибридизации in situ (рыбы) в сочетании с immunocytochemistry позволило визуализации клеточных факторов, которые colocalize с vDNA16,,1718, 19 , 20. Эти анализы позволяют для пространственного и временнóго анализа. Однако ограничения включают потребность в весьма специфических антител, ограниченной чувствительности и потребность в предыдущих понимание взаимодействия узла вирус. Поэтому мы разработали метод, основанный на iPOND (изоляция белков на зарождающейся ДНК)21 и22 aniPOND (ускоренное родной iPOND) избирательно этикетки и очистить vDNA от инфицированных клеток для объективной идентификации вирусного генома связанные белки по масс-спектрометрии. iPOND играет важную роль для исследования динамики вилка сотовой репликации.
Для выборочной очистки вирусных геномов от инфицированных клеток тиражирование vDNA помечены ethynyl изменение нуклеозидов, 5-ethynyl-2´ дезоксиуридина (EdU) или 5-ethynyl-2´ Дезоксицитидин (EdC) (рис. 1), следуют ковалентных Спряжение биотина азид через нажмите химии для облегчения очистки одного шага вирусных геномов и связанных белков на четках стрептавидина покрытием (рис. 2B). Важно отметить, что инфекции осуществляется в стационарных клетках, которые не участвуют в клеточном репликации ДНК для включения конкретных маркировки vDNA. Кроме того инфекции HSV-1 вызывает арест клеточного цикла и подавляет клеточной ДНК репликации23,–24. Вирус может быть prelabeled до инфекции для анализа белков, связанные с входящей вирусных геномов (рис. 1A) или помечены в ходе репликации ДНК для анализа белков, связанные с недавно синтезированных vDNA (рис. 1B) 25. Кроме того, пульс Чейз анализ может использоваться для изучения природы белков, связанные с вирусной репликации вилки (рис. 1 c)26. Кроме того изменение ethynyl vDNA можно ковалентно конъюгированных к Флюорофор для пространственного исследования динамики белков (рисунок 2A и рис. 3). Изображений позволяет для прямого визуализации vDNA и представляет собой бесплатный подход для проверки vDNA белковых взаимодействий и может быть адаптирована для отслеживания вирусных геномов течение инфекции. Мы ожидаем, что эти подходы далее может быть изменена для изучения любого аспекта герпетический инфекции, включая задержку и оживление и изучить другие ДНК вирусов. Кроме того маркировки с уридина 5-ethynyl (ЕС) может позволить для анализа РНК вирусных геномов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол включает в себя несколько шагов, которые, если не соблюдены тщательно, может привести к значительно более белка урожая или загрязнения с клеточной ДНК. Важно, что стационарные клетки используются для всех экспериментов для обеспечения не помечены и очищенного клеточной Д…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы признаем Ханна Fox за помощь в подготовке этой рукописи. Эта работа была поддержана NIH Грант R01AI030612.
Materials
| MRC-5 cells | ATCC | CCL-171 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-179 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12800-082 | substituted with 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 12 mM (for growth in flasks) or 30 mM (for growth in dishes) sodium-bicarbinate |
| 600 cm2 tissue culture dish | Thermo Fisher Scientific | 166508 | |
| Tris Buffered Saline (TBS), pH 7.4 | 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25.1 mM Tricine | ||
| HSV-1 stock | stocks with titers greater than 1×109 PFU/mL work best | ||
| Sephadex G-25 column (PD-10 Desalting Column) | GE Healthcare | 17085101 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-1 | |
| 5´-Ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC) | Sigma-Aldrich | T511307 | Dissolve in DMSO to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C |
| 2´-deoxycytidine (deoxyC) | Sigma-Aldrich | D3897 | Dissolve in water to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C |
| Nuclear Extraction Buffer (NEB) | prepare fresh (20 mM Hepes pH 7.2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 300 mM Sucrose, 0.5% Igepal) | ||
| Cell scraper | Bellco glass | 7731-22000 | Autoclave before use |
| Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| PBS, pH 7.2 (10x) | 1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4 (dilute to 1x in sterile water before use) | ||
| Copper (II) sulfate pentahydrate (CuSO4-5H2O) | Fisher Scientific | C489 | Prepare 100 mM stock and store at 4 °C for up to 1 month |
| (+) Sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | Freshly prepare 100 mM stock and store on ice until use |
| Biotin azide | Invitrogen | B10184 | Prepare 10 mM stock in DMSO, aliquot, and store at -20 °C for up to 1 year |
| Click Reaction Mix | prepare immediately before use by adding reagents in the indicated order (10 mL: 8.8 mL 1x PBS, 200 mL 100 mM CuSO4, 25mL 10 mM Biotin Azide, 1 mL 100 mM sodium ascorbate) | ||
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | Dissolve in 1 mL water to prepare 50x stock, can store at 4 °C for up to 1 week, or directly add 1 pill to 50 mL buffer |
| freezing buffer | prepare fresh (7 mL 100% glycerol, 3 mL NEB, 200 μL 50x protease inhibitor) | ||
| Buffer B1 | prepare fresh (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, 1x protease inhibitor) | ||
| Buffer B2 | prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0.5% Igepal, 1x protease inhibitor) | ||
| Buffer B3 | prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1x protease inhibitor) | ||
| Vibra Cell Ultra Sonic Processer equipped with a 3 mm microtip probe | Sonics | VCX 130 | |
| Cell strainer | Falcon | 352360 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Life Technologies | 65601 | |
| DynaMag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | |
| Mini-Tube Rotator | Fisher Scientific | 260750F | |
| 2X Laemmli sample buffer | Mix 400 mg of SDS, 2 mL 100% glycerol, 1.25 mL of 1 M Tris (pH 6.8), and 10 mg of bromophenol blue in 8 mL water. Store at 4 °C for up to 6 months. Before use add 1 M DTT to a final concentration of 200 mM. | ||
| cap locks for 1.5 mL tube | Fisher Scientific | NC9679153 | |
| Standard western blotting reagents | |||
| NOVEX Colloidal Blue Staining Kit | Invitrogen | LC6025 | |
| 12-well tissue culture dish | Corning | 3513 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-100 | Autoclave before use |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-552-5 | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | dilute to 3.7% in 1x PBS before use |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605 | prepare 3% in 1x PBS |
| Permeabilization buffer (0.5% Triton-X 100) | Sigma-Aldrich | T8787 | prepare 0.5% Triton-X 100 in 1x PBS |
| Click reaction cocktail – Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit | Molecular Probes | C10337 | prepare according to manufactorer's protocol |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H1399 | prepare 10 mg/mL in water, can store at 4 °C for up to 1 year |
| mouse anti-ICP8 primary antibody | Abcam | ab20194 | Use a 1:200 dilution in 1x PBS |
| mouse anti-UL42 primary antibody (2H4) | Abcam | ab19311 | Use a 1:200 dilution in 1x PBS |
| Goat anti-mouse 594-conjugated secondary antibody | Life Technologies | a11005 | Use a 1:500 dilution in 1x PBS |
| Immu-mount | Thermo Fisher Scientific | 9990402 | |
| 2x SDS-bicarb solution | 2% SDS, 200 mM NaHCO3 | ||
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | mix 25:24:1 at least 1 day before use, store at 4 °C in the dark | ||
| chloroform:isoamyl alcohol | mix 24:1 at least 1 day before use, store at room temperature in the dark | ||
| 10x Tris EDTA (TE), pH 8.0 | 100 mM Tris, 10 mM EDTA (dilute to 1x before use) | ||
| Qiaquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| 3 M sodium acetate pH 5.2 | |||
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | Q32866 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | |
| Qubit assay tubes | Invitrogen | Q32856 | |
| Fluorescence microscope equipped with imaging software | |||
| Microcentrifuge for 1.5 mL tubes | |||
| Tabletop centrifuge for 15 and 50 mL tubes | |||
| Cell culture incubator | |||
| Biosafety cabinet | |||
| Heat blocks | 65 °C and 95 °C |
Referências
- Knipe, D. M., Howley, P. M. . Fields virology. , (2013).
- Engel, E. A., Song, R., Koyuncu, O. O., Enquist, L. W. Investigating the biology of alpha herpesviruses with MS-based proteomics. Proteomics. 15, 1943-1956 (2015).
- Wagner, L. M., DeLuca, N. A. Temporal association of herpes simplex virus ICP4 with cellular complexes functioning at multiple steps in PolII transcription. PloS One. 8, e78242 (2013).
- Taylor, T. J., Knipe, D. M. Proteomics of herpes simplex virus replication compartments: association of cellular DNA replication, repair, recombination, and chromatin remodeling proteins with ICP8. J Virol. 78, 5856-5866 (2004).
- Fontaine-Rodriguez, E. C., Taylor, T. J., Olesky, M., Knipe, D. M. Proteomics of herpes simplex virus infected cell protein 27: association with translation initiation factors. Virology. 330, 487-492 (2004).
- Greco, T. M., Diner, B. A., Cristea, I. M. The Impact of Mass Spectrometry-Based Proteomics on Fundamental Discoveries in Virology. Annu Rev Virol. 1, 581-604 (2014).
- Conwell, S. E., White, A. E., Harper, J. W., Knipe, D. M. Identification of TRIM27 as a novel degradation target of herpes simplex virus 1 ICP0. J Virol. 89, 220-229 (2015).
- Suk, H., Knipe, D. M. Proteomic analysis of the herpes simplex virus 1 virion protein 16 transactivator protein in infected cells. Proteomics. 15, 1957-1967 (2015).
- Balasubramanian, N., Bai, P., Buchek, G., Korza, G., Weller, S. K. Physical interaction between the herpes simplex virus type 1 exonuclease, UL12, and the DNA double-strand break-sensing MRN complex. J Virol. 84, 12504-12514 (2010).
- Sampath, P., Deluca, N. A. Binding of ICP4, TATA-binding protein, and RNA polymerase II to herpes simplex virus type 1 immediate-early, early, and late promoters in virus-infected cells. J Virol. 82, 2339-2349 (2008).
- Amelio, A. L., McAnany, P. K., Bloom, D. C. A chromatin insulator-like element in the herpes simplex virus type 1 latency-associated transcript region binds CCCTC-binding factor and displays enhancer-blocking and silencing activities. J Virol. 80, 2358-2368 (2006).
- Cliffe, A. R., Knipe, D. M. Herpes simplex virus ICP0 promotes both histone removal and acetylation on viral DNA during lytic infection. J Virol. 82, 12030-12038 (2008).
- Herrera, F. J., Triezenberg, S. J. VP16-dependent association of chromatin-modifying coactivators and underrepresentation of histones at immediate-early gene promoters during herpes simplex virus infection. J Virol. 78, 9689-9696 (2004).
- Kent, J. R., et al. During lytic infection herpes simplex virus type 1 is associated with histones bearing modifications that correlate with active transcription. J Virol. 78, 10178-10186 (2004).
- Oh, J., Fraser, N. W. Temporal association of the herpes simplex virus genome with histone proteins during a lytic infection. J Virol. 82, 3530-3537 (2008).
- Catez, F., et al. HSV-1 genome subnuclear positioning and associations with host-cell PML-NBs and centromeres regulate LAT locus transcription during latency in neurons. PLoS Pathog. 8, e1002852 (2012).
- Everett, R. D., Murray, J., Orr, A., Preston, C. M. Herpes simplex virus type 1 genomes are associated with ND10 nuclear substructures in quiescently infected human fibroblasts. J Virol. 81, 10991-11004 (2007).
- Tang, Q., et al. Determination of minimum herpes simplex virus type 1 components necessary to localize transcriptionally active DNA to ND10. J Virol. 77, 5821-5828 (2003).
- Ishov, A. M., Maul, G. G. The periphery of nuclear domain 10 (ND10) as site of DNA virus deposition. J Cell Biol. 134, 815-826 (1996).
- Maroui, M. A., et al. Latency Entry of Herpes Simplex Virus 1 Is Determined by the Interaction of Its Genome with the Nuclear Environment. PLoS Pathog. 12, e1005834 (2016).
- Sirbu, B. M., Couch, F. B., Cortez, D. Monitoring the spatiotemporal dynamics of proteins at replication forks and in assembled chromatin using isolation of proteins on nascent DNA. Nat Protoc. 7, 594-605 (2012).
- Leung, K. H., Abou El Hassan, M., Bremner, R. A rapid and efficient method to purify proteins at replication forks under native conditions. BioTechniques. 55, 204-206 (2013).
- Hobbs, W. E., DeLuca, N. A. Perturbation of cell cycle progression and cellular gene expression as a function of herpes simplex virus ICP0. J Virol. 73, 8245-8255 (1999).
- Lomonte, P., Everett, R. D. Herpes simplex virus type 1 immediate-early protein Vmw110 inhibits progression of cells through mitosis and from G(1) into S phase of the cell cycle. J Virol. 73, 9456-9467 (1999).
- Dembowski, J. A., DeLuca, N. A. Selective recruitment of nuclear factors to productively replicating herpes simplex virus genomes. PLoS Pathog. 11, e1004939 (2015).
- Dembowski, J. A., Dremel, S. E., DeLuca, N. A. Replication-Coupled Recruitment of Viral and Cellular Factors to Herpes Simplex Virus Type 1 Replication Forks for the Maintenance and Expression of Viral Genomes. PLoS Pathog. 13, e1006166 (2017).
- Bjornberg, O., Nyman, P. O. The dUTPases from herpes simplex virus type 1 and mouse mammary tumour virus are less specific than the Escherichia coli enzyme. J Gen Virol. 77 (Pt 12), 3107-3111 (1996).
- Chiou, S. H. DNA- and protein-scission activities of ascorbate in the presence of copper ion and a copper-peptide complex. J Biochem. 94, 1259-1267 (1983).
- Kennedy, D. C., et al. Cellular consequences of copper complexes used to catalyze bioorthogonal click reactions. J Am Chem Soc. 133, 17993-18001 (2011).
- Snel, B., Lehmann, G., Bork, P., Huynen, M. A. STRING: a web-server to retrieve and display the repeatedly occurring neighbourhood of a gene. Nucleic Acids Res. 28, 3442-3444 (2000).
