Preparazione del campione e la formazione immagine di esosomi da microscopia elettronica di trasmissione
Summary
Questo protocollo descrive le varie tecniche necessarie per microscopia elettronica di trasmissione tra cui macchiatura negativa, sezionamento ultrasottile per struttura dettagliata e immuno-oro etichettatura per determinare le posizioni di specifiche proteine in esosomi.
Abstract
Gli esosomi sono vescicole extracellulari nanometriche secernute dai fluidi corporei e sono conosciuti per rappresentare le caratteristiche di cellule che secernono i loro. Il contenuto e la morfologia delle vescicole secrete riflettono comportamento delle cellule o stato fisiologico, ad esempio la crescita delle cellule, migrazione, scissione e la morte. Ruolo degli esosomi può altamente dipende dalla dimensione e la dimensione degli esosomi varia da 30 a 300 nm. Il metodo più ampiamente usato per l’imaging di esosomi è macchiatura negativa, mentre altri risultati si basano su microscopia elettronica di Cryo-trasmissione, microscopia a scansione e microscopia a forza atomica. Morfologia di esosomi tipici valutato tramite colorazione negativa è a forma di Coppa, ma ulteriori dettagli non sono ancora chiari. Un esosomi ben caratterizzati attraverso studio strutturale sono necessaria particolare in campo medico e farmaceutico. Di conseguenza, funzione dipendente dalla morfologia deve essere verificata mediante tecniche di microscopia elettronica quali etichettatura una proteina specifica in struttura dettagliata di esosomi. Per osservare la struttura dettagliata, sono state confrontate ultrasottile immagini sezionate e immagini negative macchiate di esosomi. In questo protocollo, consigliamo di microscopia elettronica di trasmissione per l’imaging di esosomi incluse macchiatura negativa intero Monte immunocolorazione, preparazione di blocco, sezione sottile ed etichettatura immuno-oro.
Introduction
Vescicole extracellulari (EVs) sono vescicole di bilayer del lipido secernute dalle cellule e loro dimensione varia tra 30 e 300 nm. SVE in primo luogo sono stati segnalati nel 1978, con evidenza dalle vescicole di pazienti con malattia di Hodgkin1. Queste vescicole sono state segnalate per essere 40 a 120 nanometri di dimensione. Nel 1980, è stato riferito che SVE sono coinvolti nel sistema di coagulazione e trombosi, formazione di un coagulo di sangue all’interno di un vaso sanguigno nel cancro pazienti2. Dopo 30 anni, EVs sono stati segnalati per essere un fattore importante per promuovere l’invasione del tumore, fuga immune e l’angiogenesi3. Inoltre, le funzioni del SVE sono state studiate come regolatori in interazioni cellulari nelle aree di infiammazione, disturbo immunitario, malattia neurologica e cancro4. Poiché EVs contengono specifici biomolecole come proteine, mRNA e microRNA5, loro potenziale applicazione in diagnostica e terapeutica è stato analizzato6,7. SVE sono una categoria composta da sottogruppi inclusi esosomi, prostasomes, oncosomes, dexosomes, microparticelle, promininosomes, argosomes e vescicole esosomi-come, a seconda della loro origine cellulare e funzione biologica3. Inoltre, basato sulla loro biogenesi, queste SVE possono essere diviso in microvescicole (capannone microvescicole, 100-1000 nm) ed esosomi (30-300 nm)8,9. Tra questi, l’esosomi sono stato segnalato come un comunicatore cellulare per risposta immunitaria10, cancro11,12e13di malattia infettiva.
Interesse per gli esosomi come biomarcatore per la diagnosi precoce sono in rapido aumento, e la purificazione e caratterizzazione di esosomi devono essere accompagnati con tecniche di imaging molecolare. Le varie dimensioni e morfologie di esosomi, a seconda della loro origine e funzione14, possono essere distinto mediante tecniche di microscopia ad alta risoluzione, come il microscopio elettronico. La maggior parte gli esosomi sono stati visualizzati da negativo macchiato microscopia elettronica in trasmissione (TEM)15,16,17, e questi risultati sono stati confermati da immunolabeling di una proteina specifica in intero supporto vescicola 18. diversi gruppi di ricerca hanno riferito alla struttura tramite scansione microscopia elettronica, microscopia a forza atomica19,20e Cryo-TEM21,22. Tuttavia, mentre queste tecniche sono utili per studiare la struttura di esosomi, sono insufficienti per osservare la posizione di specifiche proteine all’interno del esosomi. Pertanto, abbiamo introdotto un protocollo per l’imaging di esosomi con una proteina specifica etichettatura. Abbiamo applicato il blocco preparazione, sezionamento ultrasottile e immunostaining per accertare la posizione dettagliata della proteina nell’esosomi. Questo è stato confrontato con macchiatura negativa e tutta immunostaining di Monte, che è tradizionalmente utilizzato per la caratterizzazione dell’esosomi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo articolo presenta un protocollo per osservare la struttura di esosomi dettagliate e l’etichettatura delle sue proteine specifiche. Macchiatura negativa è stata considerata come il miglior metodo per esosomi17di imaging. Questa tecnica convenzionale ha mostrato la struttura a forma di Coppa degli esosomi. Tuttavia, questa forma di Coppa è una forma di manufatto che può verificarsi a causa del processo di essiccazione. Cryo-TEM risultati hanno mostrato che gli esosomi hanno una struttura p…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata sostenuta dal Bio-& programma di sviluppo tecnologia medicale della National Research Foundation (NRF) & finanziato dal governo coreano (MSIP & MOHW) (n. 2016M3A9B6904244). Ringraziamo anche i membri del centro di ricerca Bioconvergence di medicinali per la purificazione di esosomi.
Materials
| Glutaraldehyde | EMS | 16200 | |
| Sodium cacodylate | EMS | 12300 | |
| Osmium tetroxide 1 g crystal | EMS | 19100 | Use only in fume hood |
| acetone | JUNSEI | 1B2031 | |
| Spurr medium | TED PELLA | 18108 | |
| Ultra-microtome | Leica | UCT | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400 | Hazardous chemical |
| Lead citrate | EMS | 17900 | |
| Transmission Electron Microscopy | Hitachi | H7600 | |
| nickel grid | EMS | G200-Ni | |
| Copper grid | EMS | G200-Cu | |
| glycine | SIGMA | 022K5404 | |
| Phosphate buffer saline | SIGMA | P4417 | |
| Bovine serum albumin | Aurion | 25557 | |
| 1st Antibody | purification in manually | ||
| Purified anti-human CD274 (B7-H1, PD-L1) Antibody | BioLegend | 329710 | Whole mount Immumogold |
| Purified Mouse IgG2b, κ Isotype Ctrl | BioLegend | 401202 | Whole mount Immumogold (Control) |
| 2nd Anti-mouse igG conjugated 9-11 nm gold particle | sigma | G7652 | |
| silver paint | CANS | CTP100 | |
| aluminum stub | EMS | 75622 | |
| FIB-SEM | Zeiss | AURIGA | |
| Transmission Electron Microscopy | JEOL | JEM2200FS | |
| Glow discharger | JEOL | JFC1100E | |
| Carbon grid | EMS | 121119 | |
| Paraformaldehyde | EMS | 19210 | |
| Formvar carbon coated Copper Grid (200 meh) | EMS | FCF200-CU | |
| Formvar carbon coated Nickel Grid (200 mesh) | EMS | FCF200-NI |
Referências
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