Preparación de la muestra y proyección de imagen de exosomas por microscopía electrónica de transmisión
Summary
Este protocolo describe las diferentes técnicas necesarias para microscopía electrónica de transmisión como tinción negativa, seccionamiento ultrafino para estructura detallada y etiquetado para determinar las posiciones de proteínas específicas en exosomas de inmuno-oro.
Abstract
Exosomas son tamaño nanométrico vesículas extracelulares secretadas por fluidos corporales y son conocidos para representar las características de las células que segregan les. El contenido y la morfología de las vesículas de secreción reflejan comportamiento celular o estado fisiológico, por ejemplo el crecimiento celular, migración, escote y la muerte. Papel de los exosomas altamente puede depender de tamaño y el tamaño de exosomas varía de 30 a 300 nm. El método más ampliamente utilizado para la proyección de imagen de exosomas es Tinción negativa, mientras que otros resultados se basan en microscopía electrónica de crio-transmisión, microscopía electrónica y microscopía de fuerza atómica. Morfología de los exosomas típico evaluado mediante tinción negativa es una forma de Copa, pero más detalles no están claros. Un exosomas bien caracterizados a través del estudio estructural es particularmente necesario en campos médicos y farmacéuticos. Por lo tanto, morfología dependiente de la función debe ser verificada mediante técnicas de microscopía electrónica como una proteína específica en la estructura detallada de exosomas de etiquetado. Para la observación detallada de la estructura, se compararon imágenes seccionados ultrafinos y negativa teñida de exosomas. En este protocolo, sugerimos microscopía electrónica de transmisión para la proyección de imagen de exosomas como tinción negativa, todo Monte inmuno-tinción, preparación de bloque, sección delgada y etiquetado inmuno-oro.
Introduction
Las vesículas extracelulares (EVs) son vesículas bicapa de lípidos secretadas por las células y su tamaño oscila entre 30 y 300 nm. EVs primero fueron divulgado en 1978, con la evidencia de las vesículas de los pacientes con enfermedad de Hodgkin1. Estas vesículas se informaron que 40 a 120 nanómetros de tamaño. En 1980, se informó que EVs están involucrado en el sistema de coagulación y trombosis, formación de un coágulo de sangre dentro de un vaso sanguíneo en los pacientes de cáncer2. Después de 30 años, EVs se han divulgado para ser un factor importante para promover la invasión del tumor, escape inmune y angiogénesis3. Además, las funciones de los vehículos eléctricos han sido estudiadas como reguladores de las interacciones celulares en las áreas de inflamación, desorden inmune, enfermedades neurológicas y cáncer4. Ya EVs contienen biomoléculas específicas como proteínas, mRNA y microRNA5, su potencial aplicación en el diagnóstico y la terapéutica ha sido analizado6,7. EVs es una categoría conformada por subgrupos incluyendo exosomas prostasomes, oncosomes, dexosomes, micropartículas, promininosomes, argosomes y vesículas de exosomas-como, según su origen celular y función biológica3. Además, basado en su biogénesis, estos EVs pueden dividirse en microvesículas (vertiente microvesículas, 100-1000 nm) y exosomas (30-300 nm)8,9. Entre estos, los exosomas se ha divulgado como un comunicador celular respuesta inmune10, cáncer11,12y13de enfermedades infecciosas.
Interés en los exosomas como un biomarcador para el diagnóstico precoz está aumentando rápidamente, y la purificación y caracterización de exosomas deben ir acompañados de las técnicas de imagen moleculares. Los diferentes tamaños y morfologías de exosomas, dependiendo de su origen y función14, pueden distinguirse por técnicas de microscopía de alta resolución, tales como microscopia electrónica. Mayoría de exosomas fueron visualizados por tinción negativa la microscopia electrónica de transmisión (TEM)15,16,17, y estos resultados fueron confirmados por inmunomarcación de una proteína específica en Monte toda vesícula 18. varios grupos de investigación han divulgado la estructura a través de microscopía electrónica, microscopía de fuerza atómica19,20y crio-TEM21,22. Sin embargo, aunque estas técnicas son útiles para estudiar la estructura de exosomas, que son insuficientes para observar la posición de las proteínas específicas ubicadas dentro de los exosomas. Por lo tanto, hemos introducido un protocolo de exosomas con una proteína específica etiquetado de la imagen. Aplicamos el bloque preparación, seccionamiento ultrafino y el immunostaining para determinar la ubicación detallada de la proteína en los exosomas. Esto se comparó con tinción negativa y todo immunostaining de Monte, que se utiliza tradicionalmente para la caracterización de los exosomas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este artículo presenta un protocolo para observar la estructura de los exosomas detallada y etiquetado de sus proteínas específicas. Tinción negativa ha sido considerado como el mejor método de exosomas imagen17. Esta técnica convencional ha mostrado estructura en forma de Copa de exosomas. Sin embargo, esta forma de la taza es la forma del artefacto que puede ocurrir debido al proceso de secado. Crio-TEM resultados han mostrado que los exosomas tienen una estructura perfectamente esférica …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por el Bio & programa de desarrollo de tecnología médica de la Fundación Nacional de investigación (NRF) & financiado por el gobierno de Corea (MSIP & MOHW) (Nº 2016M3A9B6904244). También agradecemos a los miembros del centro de investigación de Bioconvergence de plantas medicinales para la purificación de exosomas.
Materials
| Glutaraldehyde | EMS | 16200 | |
| Sodium cacodylate | EMS | 12300 | |
| Osmium tetroxide 1 g crystal | EMS | 19100 | Use only in fume hood |
| acetone | JUNSEI | 1B2031 | |
| Spurr medium | TED PELLA | 18108 | |
| Ultra-microtome | Leica | UCT | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400 | Hazardous chemical |
| Lead citrate | EMS | 17900 | |
| Transmission Electron Microscopy | Hitachi | H7600 | |
| nickel grid | EMS | G200-Ni | |
| Copper grid | EMS | G200-Cu | |
| glycine | SIGMA | 022K5404 | |
| Phosphate buffer saline | SIGMA | P4417 | |
| Bovine serum albumin | Aurion | 25557 | |
| 1st Antibody | purification in manually | ||
| Purified anti-human CD274 (B7-H1, PD-L1) Antibody | BioLegend | 329710 | Whole mount Immumogold |
| Purified Mouse IgG2b, κ Isotype Ctrl | BioLegend | 401202 | Whole mount Immumogold (Control) |
| 2nd Anti-mouse igG conjugated 9-11 nm gold particle | sigma | G7652 | |
| silver paint | CANS | CTP100 | |
| aluminum stub | EMS | 75622 | |
| FIB-SEM | Zeiss | AURIGA | |
| Transmission Electron Microscopy | JEOL | JEM2200FS | |
| Glow discharger | JEOL | JFC1100E | |
| Carbon grid | EMS | 121119 | |
| Paraformaldehyde | EMS | 19210 | |
| Formvar carbon coated Copper Grid (200 meh) | EMS | FCF200-CU | |
| Formvar carbon coated Nickel Grid (200 mesh) | EMS | FCF200-NI |
Referências
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