Bereiding van de monsters en de beeldvorming van de Exosomes door transmissie-elektronenmicroscopie
Summary
Dit protocol beschrijft de verschillende technieken die nodig zijn voor de transmissie-elektronenmicroscopie, met inbegrip van negatieve kleuring, uiterst dunne segmenteren voor gedetailleerde structuur en immuno-goud etikettering om te bepalen van de standpunten van bepaalde eiwitten in exosomes.
Abstract
Exosomes nano-sized extracellulaire blaasjes uitgescheiden door de lichaamsvloeistoffen zijn en staan bekend om weer te geven van de kenmerken van cellen die ze afscheiden. De inhoud en de morfologie van de secreted blaasjes reflecteren cell gedrag of fysiologische status, bijvoorbeeld celgroei, migratie, decollete en dood. De exosomes rol kan sterk afhangen van grootte en de grootte van exosomes varieert van 30 tot 300 nm. De meest gebruikte methode voor exosome imaging is negatieve kleuring, terwijl andere resultaten zijn gebaseerd op Cryo-transmissie-elektronenmicroscopie, Scanning elektronenmicroscopie en Atomic Force microscopie. De typische exosome morfologie beoordeeld via negatieve kleuring is een kop-vormig, maar verdere details zijn nog niet duidelijk. Een goed gekarakteriseerd door de studie van de structurele exosome is nodig vooral in medische en farmaceutische velden. Daarom, functie-afhankelijke morfologie gecontroleerd moet worden of door elektronenmicroscopie technieken zoals het labelen van een specifieke proteïne in de gedetailleerde structuur van exosome. Om te zien hoe de gedetailleerde structuur, werden uiterst dunne verdeelde beelden en negatieve gekleurde beelden van exosomes vergeleken. In dit protocol stellen wij transmissie-elektronenmicroscopie voor de beeldvorming van exosomes met inbegrip van negatieve kleuring, hele mount immuno-kleuring, blok voorbereiding, dunne sectie en immuno-goud etikettering.
Introduction
Extracellulaire blaasjes (EVs) zijn lipide dubbelgelaagde blaasjes uitgescheiden door cellen en hun grootte varieert tussen 30 en 300 nm. EVW werden het eerst gemeld in 1978, met bewijs van blaasjes van patiënten met de ziekte van Hodgkin1. Deze blaasjes werden gemeld dat 40 tot 120 nanometer in grootte. In 1980, werd gemeld dat EVs zijn betrokken bij de stolling systeem en trombose, vorming van een bloedstolsel binnen een bloedvat in kanker patiënten2. Na 30 jaar EVs gemeld als een belangrijke factor om de invasie van de tumor, immuun ontsnappen en angiogenese3. Bovendien zijn de functies van het EVW bestudeerd als regelgevers in cellulaire interacties op het gebied van ontsteking, immuun aandoening, neurologische ziekte en kanker4. EVs bevatten specifieke biomoleculen zoals eiwitten, mRNA en microRNA5, is hun mogelijke toepassing in de diagnostiek en therapeutics sinds geanalyseerde6,7. EVW vormen een categorie bestaat uit subgroepen met inbegrip van exosomes, prostasomes, oncosomes, dexosomes, micropartikels, promininosomes, argosomes en exosome-achtige blaasjes, afhankelijk van hun cellulaire oorsprong en de biologische functie3. Bovendien, kunnen gebaseerd op hun biogenese, deze EVs worden onderverdeeld in microvesicles (loods microvesicles, 100-1000 nm) en exosomes (30-300 nm)8,9. Daaronder is de exosome gerapporteerd als een cel communicator voor immune reactie10, kanker11,12, en besmettelijke ziekte13.
Interesse in de exosomes als een biomarker voor vroegtijdige diagnose neemt snel toe, en de zuivering en karakterisering van exosomes moeten gepaard met moleculaire beeldvormingstechnieken. De verschillende maten en morphologies van exosomes, afhankelijk van hun oorsprong en functie14, kunnen worden onderscheiden door microscopie technieken met hoge resolutie, zoals elektronenmicroscopie. De meeste exosomes waren gevisualiseerd door negatief gekleurd transmissie-elektronenmicroscopie (TEM)15,16,17, en deze resultaten werden bevestigd door immunolabeling van een bepaalde eiwit in hele mount vesikel 18. verschillende onderzoeksgroepen hebben melding gemaakt van de structuur door middel van Scanning elektronenmicroscopie en Atomic Force microscopie19,20Cryo-TEM21,22. Terwijl deze technieken nuttig zijn voor het bestuderen van de structuur van de exosome, zijn ze echter onvoldoende voor de observatie van de positie van specifieke proteïnen bevindt zich in de exosome. Daarom introduceerden we een protocol voor imaging-exosomes met een specifieke proteïne etikettering. We toegepast blok voorbereiding, uiterst dunne afdelen en immunokleuring voor het vaststellen van de gedetailleerde ligging van het eiwit in de exosome. Dit werd vergeleken met negatieve kleuring en hele mount immunokleuring, die traditioneel wordt gebruikt voor de karakterisering van de exosome.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit artikel presenteert een protocol voor het observeren van de gedetailleerde exosome structuur en etikettering van haar specifieke proteïnen. Negatieve kleuring heeft beschouwd als de beste methode voor exosome imaging17. Deze conventionele techniek leert exosomes’ cup-vormige structuur. Deze vorm van de kop is echter een vorm van artefact die als gevolg van het droogproces optreden kan. Cryo-TEM resultaten hebben aangetoond dat exosomes een perfect bolvormige structuur in waterige oplossing<su…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gesteund door de Bio & medische technologie Development Program van de nationale Stichting voor onderzoek (NRF) & gefinancierd door de Koreaanse overheid (MSIP & MOHW) (nr. 2016M3A9B6904244). Wij danken ook leden van het onderzoekscentrum voor medicinaal Bioconvergence voor zuivering van exosome.
Materials
| Glutaraldehyde | EMS | 16200 | |
| Sodium cacodylate | EMS | 12300 | |
| Osmium tetroxide 1 g crystal | EMS | 19100 | Use only in fume hood |
| acetone | JUNSEI | 1B2031 | |
| Spurr medium | TED PELLA | 18108 | |
| Ultra-microtome | Leica | UCT | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400 | Hazardous chemical |
| Lead citrate | EMS | 17900 | |
| Transmission Electron Microscopy | Hitachi | H7600 | |
| nickel grid | EMS | G200-Ni | |
| Copper grid | EMS | G200-Cu | |
| glycine | SIGMA | 022K5404 | |
| Phosphate buffer saline | SIGMA | P4417 | |
| Bovine serum albumin | Aurion | 25557 | |
| 1st Antibody | purification in manually | ||
| Purified anti-human CD274 (B7-H1, PD-L1) Antibody | BioLegend | 329710 | Whole mount Immumogold |
| Purified Mouse IgG2b, κ Isotype Ctrl | BioLegend | 401202 | Whole mount Immumogold (Control) |
| 2nd Anti-mouse igG conjugated 9-11 nm gold particle | sigma | G7652 | |
| silver paint | CANS | CTP100 | |
| aluminum stub | EMS | 75622 | |
| FIB-SEM | Zeiss | AURIGA | |
| Transmission Electron Microscopy | JEOL | JEM2200FS | |
| Glow discharger | JEOL | JFC1100E | |
| Carbon grid | EMS | 121119 | |
| Paraformaldehyde | EMS | 19210 | |
| Formvar carbon coated Copper Grid (200 meh) | EMS | FCF200-CU | |
| Formvar carbon coated Nickel Grid (200 mesh) | EMS | FCF200-NI |
Referências
- Friend, C., et al. Observations on cell lines derived from a patient with Hodgkin’s disease. Cancer Res. 38 (8), 2581-2591 (1978).
- Dvorak, H. F., et al. Tumor shedding and coagulation. Science. 212 (4497), 923-924 (1981).
- Zaborowski, M. P., Balaj, L., Breakefield, X. O., Lai, C. P. Extracellular Vesicles: Composition, Biological Relevance, and Methods of Study. Bioscience. 65 (8), 783-797 (2015).
- Yanez-Mo, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4, 27066 (2015).
- Wu, Y., Deng, W., Klinke, D. J. Exosomes: improved methods to characterize their morphology, RNA content, and surface protein biomarkers. Analyst. 140 (19), 6631-6642 (2015).
- Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell Mol Life Sci. 68 (16), 2667-2688 (2011).
- Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases. Pharmacol Ther. , (2017).
- Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochim Biophys Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).
- Villarroya-Beltri, C., Baixauli, F., Gutierrez-Vazquez, C., Sanchez-Madrid, F., Mittelbrunn, M. Sorting it out: regulation of exosome loading. Semin Cancer Biol. 28, 3-13 (2014).
- Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
- Camussi, G., Deregibus, M. C., Bruno, S., Cantaluppi, V., Biancone, L. Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication. Kidney Int. 78 (9), 838-848 (2010).
- Zaharie, F., et al. Exosome-Carried microRNA-375 Inhibits Cell Progression and Dissemination via Bcl-2 Blocking in Colon Cancer. J Gastrointestin Liver Dis. 24 (4), 435-443 (2015).
- Fuhrmann, G., Neuer, A. L., Herrmann, I. K. Extracellular vesicles – a promising avenue for the detection and treatment of infectious diseases?. Eur J Pharm Biopharm. , (2017).
- Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. J Extracell Vesicles. 3, 26913 (2014).
- Liu, X., Wang, H. W. Single particle electron microscopy reconstruction of the exosome complex using the random conical tilt method. J Vis Exp. (49), (2011).
- Wang, J., Yao, Y., Wu, J., Li, G. Identification and analysis of exosomes secreted from macrophages extracted by different methods. Int J Clin Exp Pathol. 8 (6), 6135-6142 (2015).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , 22 (2006).
- Mazzeo, C., et al. Exosome secretion by eosinophils: A possible role in asthma pathogenesis. J Allergy Clin Immunol. 135 (6), 1603-1613 (2015).
- Sokolova, V., et al. Characterisation of exosomes derived from human cells by nanoparticle tracking analysis and scanning electron microscopy. Colloids Surf B Biointerfaces. 87 (1), 146-150 (2011).
- Sharma, S., et al. Structural-mechanical characterization of nanoparticle exosomes in human saliva, using correlative AFM, FESEM, and force spectroscopy. ACS Nano. 4 (4), 1921-1926 (2010).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).
- Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Sci Rep. 6, 36162 (2016).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031 (2015).
- Kim, S. B., et al. Caspase-8 controls the secretion of inflammatory lysyl-tRNA synthetase in exosomes from cancer cells. J Cell Biol. , (2017).
- Conde-Vancells, J., et al. Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes. J Proteome Res. 7 (12), 5157-5166 (2008).
- Kadiu, I., Narayanasamy, P., Dash, P. K., Zhang, W., Gendelman, H. E. Biochemical and biologic characterization of exosomes and microvesicles as facilitators of HIV-1 infection in macrophages. J Immunol. 189 (2), 744-754 (2012).
- Gong, J., Korner, R., Gaitanos, L., Klein, R. Exosomes mediate cell contact-independent ephrin-Eph signaling during axon guidance. J Cell Biol. 214 (1), 35-44 (2016).
- Melo, S. A., et al. Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer. Nature. 523 (7559), 177-182 (2015).
- Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat Cell Biol. 9 (6), 654-659 (2007).
- van Niel, G., Heyman, M. The epithelial cell cytoskeleton and intracellular trafficking. II. Intestinal epithelial cell exosomes: perspectives on their structure and function. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 283 (2), G251-G255 (2002).
