Generation af diskriminerende menneskelige monoklonale antistoffer fra sjældne Antigen-specifikke B celler cirkulerer i blodet

Summary

Vi beskriver en metode til produktion af humane antistoffer specifikke for et antigen af interesse, med udgangspunkt i sjældne B celler cirkulerer i humant blod. Generation af disse naturlige antistoffer er effektiv og hurtig, og antistofferne fremstillet kan forskelsbehandle stærkt relaterede antigener.

Abstract

Monoklonale antistoffer (papagøjesyge) er kraftfulde værktøjer nyttigt for både grundforskning og i biomedicin. Deres høj specificitet er uundværlig, når antistoffet skal skelne mellem stærkt relaterede strukturer (fx, en normal protein og en muteret version heraf). Den nuværende måde at generere sådanne diskriminerende mAbs indebærer omfattende screening af flere Ab-producerende B-celler, som er både kostbar og tidskrævende. Vi foreslår her en hurtig og omkostningseffektiv metode til generation af diskriminerende, fuldt humane mAbs startende fra humant blod cirkulerende B-lymfocytter. Originaliteten af denne strategi er Udvalget af specifikke antigen bindende B celler kombineret med Counter markeringen af alle andre celler, ved hjælp af let tilgængelige perifert blod mononukleære celler (PBMC). Når specifikke B-celler er isoleret, er cDNA (supplerende deoxyribonukleinsyre) sekvenser, der koder for den tilsvarende mAb opnået ved hjælp af enkelt celle Reverse transkription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) teknologi og efterfølgende udtrykt i menneskelige celler. Inden for så lidt som 1 måned er det muligt at producere milligram af yderst diskriminerende menneskelige mAbs rettet mod stort set alle ønskede antigen naturligvis opdaget af B-celle repertoire.

Introduction

Metoden beskrevet her giver mulighed for hurtig og alsidig produktion af fuldt humane monoklonale antistoffer (papagøjesyge) mod en ønskede antigen (Ag). mAbs er uundværlige redskaber i mange grundlæggende forskning applikationer in vitro og i vivo: flow flowcytometri, histologi, western blotting og blokerende eksperimenter f.eks. Derudover anvendes mAbs mere og mere i medicin til behandling af autoimmune sygdomme, kræft, og til at styre transplantation afvisning¹. For eksempel, blev anti-CTLA-4 og anti-PD-1 (eller anti-PD-L1) mAbs for nylig brugt som immun checkpoint hæmmere i kræft behandlinger².

De første mAbs blev produceret af immunglobulin (Ig)-secernerende hybridomer fremstillet af milt cellerne i immuniserede mus eller rotter. Men den stærke immunrespons mod murine eller rotte mAbs hæmmer deres terapeutiske brug i mennesker, på grund af deres hurtig clearance og den sandsynlige fremkaldelse af overfølsomhed reaktioner³. For at tackle dette problem, er animalsk protein sekvenser af mAbs blevet delvist erstattet af menneskelige dem til at generere såkaldte kimære Mus-menneskelige eller humaniseret antistoffer. Denne strategi falder dog kun delvist immunogenicitet, samtidig væsentligt øge omkostningerne og tidshorisont for produktion. En bedre løsning er at skabe menneskelige mAbs direkte fra menneskelige B-celler og flere strategier for dette er tilgængelige. En af dem er brugen af phage eller gær display. Dette omfatter visning af variable domæner fra en kombinatorisk bibliotek af tilfældige menneskers Ig tunge og lys kæder på phages eller gær og foretage en udvælgelse trin ved hjælp af den specifikke antigen af interesse. En væsentlig ulempe ved denne strategi er, at tunge og lette kæder er tilfældigt forbundet, fører til en meget stor stigning i mangfoldigheden af genererede antistoffer. Antistoffer opnået er usandsynligt at svare til dem, der ville opstå fra en naturlige immunrespons mod en bestemt Ag. Desuden er menneskelige proteinfoldning og posttranslationelle modifikationer ikke systematisk gengivet i prokaryoter eller endda i gær. En anden humane mAb produktionsmetode er immortalization af naturlige menneskelige B-celler ved Epstein – Barr virusinfektion eller udtryk for anti-apoptotiske faktorer BCL-6 og BCL-XL⁴. Men denne metode gælder kun for hukommelse B-celler og er ineffektive, der kræver screening af talrige mAb-producerende udødeliggjort B celler til at identificere par (hvis nogen) mAb kloner med den ønskede antigene specificitet. Metoden er således både dyrt og tidskrævende.

En ny protokol er for nylig blevet beskrevet for produktion af menneskelige mAbs fra isolerede enkelt B celler⁵. Det bygger på en optimeret enkelt celle Reverse transkription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) til forstærkning af både heavy – og lys-kæden kodning segmenter fra en enkelt sorteret B celle. Dette er efterfulgt af kloning og udtryk for disse segmenter i en eukaryote ekspressionssystem, således at genopbygningen af et fuldt humane mAb. Denne protokol har været anvendt med held startende fra B-celler fra vaccinerede donorer. Celler er høstet adskillige uger efter vaccination til at opnå højere frekvenser af B-celler rettet mod den ønskede Ag, og dermed begrænse den tid, der kræves til screening af⁶. Andre fuldt humane mAbs er også fremstillet af HIV⁺ (Human immundefekt Virus) inficerede patienter⁷ og melanom patienter⁸. Trods disse fremskridt er der stadig ingen procedure tilgængelig, der muliggør dyrkning af Ag-specifikke B celler uafhængigt af deres hukommelse fænotype eller frekvens.

Proceduren beskrevet her fører til effektiv ex vivo isolation af menneskelige cirkulerende B-celler baseret på deres BCR specificitet, efterfulgt af produktionen af fuldt humane antigen-specifikke mAbs i højt udbytte og med en lav screening tid. Metoden er ikke begrænset til hukommelse B celler eller antistof-secernerende B celler inducerede efter en immunrespons, men kan også anvendes til menneskelige naive B-celle repertoire. At det virker endda med udgangspunkt i Ag-specifikke B celler stede ved meget lave frekvenser er en god indikation af dens effektivitet. Princippet om metoden er som følger: perifert blod mononukleære celler (PBMC) farves med to tetramers præsenterer antigen af interesse, hver mærket med en anden fluorokrom (fxPhycoerythrin (PE) og Allophycocyanin (APC)), og en tredje tetramer præsenterer et nært beslægtede antigen konjugeret med et tredje fluorokrom (fxBrillant Violet 421 (BV421)). For at berige for antigen-bindende celler, celler er derefter inkuberes med perler belagt med anti-PE og anti-APC Abs, og sorteret i celle adskillelse kolonner. PE⁺ APC⁺ celle brøkdel er valgt, farves med en bred vifte af mAbs specifikke for forskellige PBMC celletyper identificering af B-celler, og underkastet flyde flowcytometri celle sortering. B-celler, som er PE⁺ og APC⁺, men strålende Violet^–, er isoleret. Dette skridt vælger mod celler, der er ikke B-celler eller ikke binder sig til den tetramerized antigen, men binder til enten PE eller APC (disse celler vil være PE⁺ APC^– eller PE^– APC⁺) eller til den antigen-del af tetramers anvendes (disse cellerne bliver BV421⁺). B-celler ikke meget specifikke for epitop af interesse er også mod valgt på dette trin (disse celler vil også være BV421⁺). Således, denne metode kan rense særdeles specifikke B-celler udtrykker B-celle receptorer (oplysningspligt) stand til at skelne mellem to meget nært beslægtede antigener. Enkelt specifikke B-celler er indsamlet i rør og deres PCR-forstærket Ig cDNAs (supplerende desoxyribonukleinsyre syrer) klonet og udtrykt af en human cellelinie som udskilles IgG mAbs.

Som en proof of concept, denne undersøgelse beskriver den effektive generation af menneskelige mAbs, som anerkender et peptid præsenteret ved et større histocompatibility komplekse klasse (MHC-jeg) molekylet og kan skelne mellem dette peptid og andre peptider indlæst på samme MHC-jeg allel. Selv om kompleksiteten af denne Ag er vigtig, tillader denne metode (i) højt udbytte opsving af Ag-specifikke mAbs; (ii) produktionen af mAbs stand til at skelne mellem to strukturelt tæt Ags. Denne fremgangsmåde kan udvides til at omfatte vaccineret eller inficerede patienter uden enhver aendring af protokollen, og også allerede har gennemført med succes i en humaniseret rotte system⁹. Således, denne undersøgelse beskriver en alsidig og effektiv fremgangsmåde for at generere fuldt humane mAbs, der kan bruges i grundforskning og immunterapi.

Protocol

Alle menneskelige perifert blodprøver blev indhentet fra anonyme voksne donorer efter informeret samtykke, i overensstemmelse med den lokale etiske komité (Etablissement Français du Sang, EFS, Nantes, procedure PLER NTS-2016-08). 1. isolering af humant perifert blod mononukleære celler Bemærk: Start materiale kan være samlede humant perifert blod eller cytapheresis prøver. Prøverne bør ikke være ældre end 8 h og suppleret med antikoagulantia (fx, h…

Representative Results

Start fra PBMC fra raske donorer, dette projekt præsenterer generation af menneskelige mAbs, der anerkender peptid Pp65495 (Pp65, fra menneskelig cytomegalovirus) præsenteret af de store histocompatibility komplekse klasse jeg (MHC-jeg) molekyle () HLA – A * 0201 HLA-A2). Disse mAbs kan diskriminere mellem denne komplekse og komplekser, der repræsenterer andre peptider læsset på den samme MHC-jeg molekyle. PBMC v…

Discussion

Den foreslåede protokol er en kraftfuld metode for generation af menneskelige mAbs direkte fra Ag-specifikke B celler cirkulerer i blodet. Det kombinerer tre vigtige aspekter: (i) anvendelse af en tetramer-associerede magnetiske berigelse, som giver mulighed for en ex vivo isolation af endda sjældne Ag-bindende B celler; (ii) en gating strategi, der bruger tre Ag tetramers (to relevante dem og en irrelevant én) mærket med tre forskellige fluorokromer til at isolere, ved flowcytometri, kun B-celler udtrykker …

Materials

HEK 293A cell line	Thermo Fisher scientific	R70507
DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco by life technologies	21969-035	(+) 4,5g/L D-Glucose 0,11g/L Sodium Pyruvate (-) L-Glutmine
RPMI medium1640 (1X)	Gibco by life technologies	31870-025
Bovine Serum Albumine (BSA)	PAA	K45-001
Nutridoma-SP	Roche	11011375001	100X Conc
PBS-Phosphate Buffered Saline (10X) pH 7,4	Ambion	AM9624
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) 0,5M pH=8	Invitrogen by Life Technologies	15575-020
Fetal Bovine serum (FBS)	Dominique Dutscher	S1810-500
Ficoll – lymphocytes separation medium	EuroBio	CMSMSL01-01	density 1,0777+/-0,001
streptavidin R-phycoerythrin conjugate	Invitrogen by Life Technologies	S21388	premiun grade 1mg/ml contains 5mM sodium azide
Streptavidin, allophycocyanin conjugate	Invitrogen by thermoFisher scientific	S32362	1mg/ml 2mM azide premium grade
Brilliant violet 421 streptavidin	Biolegend	405225	conc : 0,5mg/ml
Anti-PE conjugated magnetic MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-048-801
Anti-APC conjugated magnetic MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-090-855
MidiMACs or QuadroMACS separotor	Miltenyi Biotec	130-042-302/130-090-976
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
CD3 BV510 BD horizon	BD Pharmingen / BD Biosciences	563109	Used dilution 1:20
CD19 FITC	BD Pharmingen / BD Biosciences	345788	Used dilution 1:20
CD14 PerCPCy5.5	BD Pharmingen / BD Biosciences	561116	Used dilution 1:50
CD16 PerCPCy5.5	BD Pharmingen / BD Biosciences	338440	Used dilution 1:50
7AAD	BD Pharmingen / BD Biosciences	51-68981E (559925)	Used dilution 1:1000
FACS ARIA III Cell Sorter Cytometer	BD Biosciences
8-strip PCR tubes	Axygen	321-10-061
Racks for 96 microtubes	Dominique Dutscher	45476
RNAseOUT Ribonuclease Inhibitor (recombinant)	Invitrogen by thermoFisher scientific	10777-019	qty:5000U (40U/ul)
Distilled Water Dnase/Rnase Free	Gibco	10977-035
Oligod(T)18 mRNA Primer	New England BioLabs	S1316S	5.0 A260unit
Random hexamers	Invitrogen by thermoFisher scientific	N8080127	qty : 50uM, 5nmoles
Superscript III Reverse transcriptase	Invitrogen by thermoFisher scientific	18080-044	qty : 10000U (200U/ul)
GoTaq G2 Flexi DNA polymerase	Promega	M7805
dNTP Set, Molecular biology grade	Thermo Scientific	R0182	4*100umol
5LVH1	Eurofins	ACAGGTGCCCACT CCCAGGTGCAG	First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers
5LVH3	Eurofins	AAGGTGTCCAGTG TGARGTGCAG	First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers
5LVL4_6	Eurofins	CCCAGATGGGTCC TGTCCCAGGTGCAG	First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers
5LVH5	Eurofins	CAAGGAGTCTGTT CCGAGGTGCAG	First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers
3HuIgG_const_anti	Eurofins	TCTTGTCCACCTT GGTGTTGCT	First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers -Reverse primers for human Ig- Bacteria PCR screening
3CuCH1	Eurofins	GGGAATTCTCACA GGAGACGA	First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers -Reverse primers for human Ig
5AgeIVH1_5_7	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC GAGGTGCAGCTGGTGCAG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGGTGGAG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3_23	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGTTGGAG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH4	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTGCAGGAG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH4_34	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTACAGCAGTG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH1_18	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTTCAGCTGGTGCAG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH1_24	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTCCAGCTGGTACAG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3__9_30_33	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCT GAAGTGCAGCTGGTGGAG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH6_1	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTACAGCTGCAGCAG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
3SalIJH1_2_4_5	Eurofins	TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCAG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Reverse primers
3SalIJH3	Eurofins	TGCGAAGTCGACG CTGAAGAGACGGTGACCATTG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Reverse primers
3SalIJH6	Eurofins	TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCGTG	Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Reverse primers
5'LVk1_2	Eurofins	ATGAGGSTCCCYG CTCAGCTGCTGG	First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Forward primers
5'LVk3	Eurofins	CTCTTCCTCCTGC TACTCTGGCTCCCAG	First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Forward primers
5'LVk4	Eurofins	ATTTCTCTGTTGC TCTGGATCTCTG	First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Forward primers
3'Ck543_566	Eurofins	GTTTCTCGTAGTC TGCTTTGCTCA	First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Reverse primers- Bacteria PCR screening
5'AgeIVk1	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCT GACATCCAGATGACCCAGTC	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk1_9_1–13	Eurofins	TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk1D_43_1_8	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTGT GCCATCCGGATGACCCAGTC	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk2	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACCCAGAC	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk2_28_2_30	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACTCAGTC	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeVk3_11_3D_11	Eurofins	TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTTGACACAGTC	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeVk3_15_3D_15	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCA GAAATAGTGATGACGCAGTC	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeVk3_20_3D_20	Eurofins	TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTTGACGCAGTCT	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeVk4_1	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCG GACATCGTGATGACCCAGTC	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk1_2_4	Eurofins	GCCACCGTACGTT TGATYTCCACCTTGGTC	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk3	Eurofins	GCCACCGTACGTT TGATATCCACTTTGGTC	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk5	Eurofins	GCCACCGTACGTT TAATCTCCAGTCGTGTC	Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'LVl1	Eurofins	GGTCCTGGGCCCA GTCTGTGCTG	First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'LVl2	Eurofins	GGTCCTGGGCCCA GTCTGCCCTG	First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'LVl3	Eurofins	GCTCTGTGACCTC CTATGAGCTG	First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'LVl4_5	Eurofins	GGTCTCTCTCSCA GCYTGTGCTG	First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'LVl6	Eurofins	GTTCTTGGGCCAA TTTTATGCTG	First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'LVl7	Eurofins	GGTCCAATTCYCA GGCTGTGGTG	First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5LVl8	Eurofins	GAGTGGATTCTCA GACTGTGGTG	First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
3'Cl	Eurofins	CACCAGTGTGGCC TTGTTGGCTTG	First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'AgeIVl1	Eurofins	CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGTGCTGACKCAG	Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
5'AgeIVl2	Eurofins	CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGCCCTGACTCAG	Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
5'AgeIVl3	Eurofins	CTGCTACCGGTTCTGTGACC TCCTATGAGCTGACWCAG	Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
5'AgeIVl4_5	Eurofins	CTGCTACCGGTTCTCTCTCS CAGCYTGTGCTGACTCA	Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
5'AgeIVl6	Eurofins	CTGCTACCGGTTCTTGGGCC AATTTTATGCTGACTCAG	Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
5'AgeIVl8	Eurofins	CTGCTACCGGTTCCAATTCY CAGRCTGTGGTGACYCAG	Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
3'XhoICl	Eurofins	CTCCTCACTCGAG GGYGGGAACAGAGTG	Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -Reverse primers – Bacteria PCR screening
Ab-vec-sense	Eurofins	GCTTCGTTAGAAC GCGGCTAC	Bacteria PCR screening
QA Agarose-TM, Molecular Biology Grade	MP Bio	AGAH0500
NucleoFast 96 PCR Plate	Macherey Nagel	743.100.100
Enzyme Age I HF	New England Biolabs	R3552L	20000U/ml
Enzyme SalI HF	New England Biolabs	R3138L	20000U/ml
Enzyme Xho I	New England Biolabs	R0146L	20000U/ml
Enzyme BSIWI	New England Biolabs	R0553L	10000U/ml
HCg1 (Genbank accession number FJ475055)
LCk (Genbank accession number FJ475056 )
LCl (Genbank accession number FJ517647)
T4 DNA ligase	Invitrogen by thermoFisher scientific	15224.017	100U (1U/ul)
2X YT medium	Sigma Aldrich	Y1003-500ML
Ampicillin	Sigma Aldrich	10835242001
LB (Luria Bertani) Broth (Lennox)	Sigma Aldrich	L3022-250G
Nucleospin Plasmid DNA, RNA and protein purification	Macherey Nagel	740588.250
Jet PEI DNA transfection reagent	PolyPlus	101-40
Flat bottom96-well plate	Falcon	353072
V-bottom 96-well plate	Nunc/Thermofisher	055142
Nunc easy 175 cm2 flasks	Nunc/Thermofisher	12-562-000
ELISA/ELISPOT coating buffer	eBiosciences	00-0044-59
Nunc maxisorp flat bottom 96 well ELISA plates	Nunc/Thermofisher	44-2404-21	high protein binding
Anti-human IgG Ab conjugated to horseradish peroxidase (HRP)	BD Pharmingen / BD Biosciences	55788
TMB substrate	BD Biosciences	555214
Streptavidin	Sigma	S0677
1 mL-HiTrap protein A HP column	GE Healthcare	17-0402-01
ÄKTA FPLC	GE Healthcare	18190026
Superdex 200 10/300 GL column	GE Healthcare	17517501
NGC Quest 10 Plus Chromatography System	BioRad	7880003