Isolatie van Intact, hele muis borstklieren p.a. van extracellulaire Matrix expressie en klier morfologie
Summary
Hier presenteren we een protocol voor de isolatie van geheel, intact muis borstklieren om te onderzoeken van de extracellulaire matrix (ECM) expressie en ductaal morfologie. Muis #4 abdominale klieren werden gehaald uit de 8-10 week oude vrouwelijke nullipaar muizen, vast in neutraal gebufferde formaline, gesegmenteerd en gekleurd met behulp van immunohistochemistry voor ECM eiwitten.
Abstract
Het doel van deze procedure was om te oogsten van de #4 abdominale borstklieren van vrouwelijke nullipaar muizen teneinde ECM expressie en ductaal architectuur. Hier is een klein zakje onder de huid gemaakt met behulp van Mayo schaar, waarmee een scheiding van de klieren in het onderhuidse weefsel van de onderliggende buikvlies. Visualisatie van de klieren was geholpen door het gebruik van 3.5 x-R chirurgische micro loupes. De pelt werd omgekeerd en gespeld terug waardoor identificatie van de intact borstklier vet pads. Elk van de #4 abdominale klieren was ronduit ontleed door te schuiven van het scalpel blad lateraal tussen de subcutane laag en de klieren. Onmiddellijk na de oogst, de klieren werden geplaatst in 10% neutraal gebufferde formaline voor latere bewerking. Excisie van de hele klier is voordelig omdat het voornamelijk het risico elimineert uit te sluiten van belangrijke weefsel bestrijkende interacties tussen ductaal epitheliale cellen en andere microenvironmental cellulaire populaties die kunnen worden gemist in een gedeeltelijke biopsie. Een nadeel van de methode is het gebruik van seriële secties uit vaste weefsels die analyses van ductaal genuitdrukking en eiwit expressie naar een discrete locatie in de klier beperkt. Wijzigingen in ductaal architectuur en eiwit expressie in 3 dimensies (3D) is als zodanig niet makkelijk verkrijgbare. De techniek is over het algemeen van toepassing op studies vereisen geheel intact lymfkliertest borstklieren voor downstream onderzoeken zoals ontwikkelingsstoornissen ductaal morfogenese of borst kanker.
Introduction
Borstkanker wordt gekenmerkt door een aanzienlijke mate van weefsel fibrose1,2,3,4. Hierna de ECM, deze niet-cellulair entiteit wordt gevonden in wisselend in alle weefsels en bestaat voornamelijk uit een complexe Zitschalen van fibrillar en niet-fibrillar collagens, elastine en glycoproteïnen naast verschillende signalering moleculen die zijn afgezonderd in deze matrix. Homeostatische omstandigheden, is de afzetting en de aantasting van de ECM streng gecontroleerd. 5 tijdens borst tumorvorming, het evenwicht van ECM afzetting en afbraak wordt verstoord. Tumoren van de borst zijn als zodanig gemeld uitspreken overvloedige ECM eiwitten zoals collagens, fibronectin en tenascin-C o.a.. 6 de abnormale uitdrukking van deze proteïnen naast verhoogde patronen van matrix crosslinking is gedocumenteerd ter bevordering van de borst tumor progressie, metastase en therapie resistentie1,3, 4,7,8,9.
Om te beoordelen ECM samenstelling en ductaal morfologie, werd isolatie van intact borstklieren uitgevoerd. Hier hebben we vrouwelijke nullipaar muizen gebrekkig gebruikt voor caveolin-1, een integraal membraan eiwit die is gekoppeld aan een agressieve borstkanker tumor handtekening10,11,12, en controle over vrouwelijke nullipaar B6 muizen. Histologische verwerking en kleuring van deze weefsels toegestaan de identificatie van verschillende ECM eiwitten samen met de karakterisering van ductaal morfologie.
Over het geheel genomen geeft het isolement van geheel, intact borstklieren onderzoekers de mogelijkheid te onderzoeken weefsel bestrijkende morfologische of cellulaire veranderingen naar aanleiding van exogene of endogene factoren. Nadelen van de techniek worden geassocieerd met analyses van 2 dimensie (2D) weefselsecties in tegenstelling tot een 3D perspectief, die een vollediger beeld van de complexe morfologie van de ductaal boom zou opleveren. Gezien de complexiteit van cel-cel en cel-ECM interacties die in de melkklier plaatsvinden, is het isolement van de klieren van het geheel, intact gunstig voor het efficiënt analyseren ductaal morfologie en eiwit expressie in verschillende regio’s van de borstklier RattenUitrustingen klier.
Protocol
Representative Results
Discussion
In de krant, hebben we een techniek om te isoleren van de borstklieren intact muis voor downstream histologische analyses van ECM expressie en ductaal morfologie beschreven. Met betrekking tot de analyses van ductaal morfologie maakt deze methode het snelle onderzoek van ductaal het platform gebaseerd off van gebeitst histologische secties. Andere methoden van ductaal analyses, is afhankelijk van injecties van kleurstoffen om de visualisatie van de ductaal boom, methoden die technisch uitdagende en tijdrovend kunnen zijn…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs wil erkennen April Wiles en Dr. Roger Broderson voor hulp bij het dierlijke necropsie en isolatie van de klier, respectievelijk. Financiering voor dit werk werd gesteund door de Philadelphia College of Osteopatisch Medicine centra voor chronische aandoeningen of Aging.
Materials
| Light Microscope | Olympus | BX43 | |
| Microscope Camera | Olympus | DP73 | |
| Image Analysis Software | Olympus | cellSens Entry software | |
| NIH | ImageJ | ||
| 3.5x-R Surgical Micro Loupes | Rose Micro Solutions | Magnification at researcher's preference | |
| Mayo Scissors | Medline | DYND04035 | |
| Staining Rack | Fisher Scientific | 121 | |
| Staining Dish | Fisher Scientific | 112 | |
| Coplin Jars | Fisher Scientific | 19-4 | |
| Glass coverslips | Fisher Scientific | 12-550-15 | Size appropriate for tissue |
| IHC EnVision+ Kit (HRP, Mouse, DAB+) | Dako | K400611-2 | |
| Picrosirius Red Kit | Abcam | AB150681 | |
| Eosin Y, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110132 | |
| Harris Hematoxylin | Sigma-Aldrich | HHS16 | |
| Donkey Serum | EMD Millipore | S30 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Xylenes, Reagent Grade | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Ethanol, 200 proof | Sigma-Aldrich | 792780 | suitable for molecular biology |
| Phosphate Buffered Saline, 1x | Gibco | 10010023 | |
| Sodium Citrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Calcium Carbonate | Sigma-Aldrich | 202932 | |
| Permanent Mounting Medium | Dako | S1964 | |
| Eukitt's Mounting Medium | Sigma-Aldrich | 3989 | |
| Fibronectin antibody | Abcam | AB23750 | |
| Tenascin-C antibody | Abcam | AB108930 | |
| Alpha Smooth Muscle Actin antibody | Abcam | AB124964 | |
| Dako Envision Dual Link System HRP | Dako | K4065 |
Referências
- Gao-Feng Xiong, R. X. Function of cancer cell-derived extracellular matrix in tumor progression. J Cancer Metastasis Treat. 2, 357-364 (2016).
- Place, A. E., Jin Huh, S., Polyak, K. The microenvironment in breast cancer progression: biology and implications for treatment. Breast Cancer Res. 13 (6), 227 (2011).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4 (1), 38 (2006).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Med. 6, 11 (2008).
- Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer. Dis Model Mech. 4 (2), 165-178 (2011).
- Ioachim, E., et al. Immunohistochemical expression of extracellular matrix components tenascin, fibronectin, collagen type IV and laminin in breast cancer: their prognostic value and role in tumour invasion and progression. Eur J Cancer. 38 (18), 2362-2370 (2002).
- Barkan, D., et al. Metastatic growth from dormant cells induced by a col-I-enriched fibrotic environment. Cancer Res. 70 (14), 5706-5716 (2010).
- Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139 (5), 891-906 (2009).
- Wang, J. P., Hielscher, A. Fibronectin: How Its Aberrant Expression in Tumors May Improve Therapeutic Targeting. J Cancer. 8 (4), 674-682 (2017).
- Qian, N., et al. Prognostic significance of tumor/stromal caveolin-1 expression in breast cancer patients. Cancer Sci. 102 (8), 1590-1596 (2011).
- Simpkins, S. A., Hanby, A. M., Holliday, D. L., Speirs, V. Clinical and functional significance of loss of caveolin-1 expression in breast cancer-associated fibroblasts. J Pathol. 227 (4), 490-498 (2012).
- Witkiewicz, A. K., et al. An absence of stromal caveolin-1 expression predicts early tumor recurrence and poor clinical outcome in human breast cancers. Am J Pathol. 174 (6), 2023-2034 (2009).
- Macias, H., Hinck, L. Mammary gland development. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (4), 533-557 (2012).
- Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Curr Protoc Neurosci. , (2009).
- Cannata, D., et al. Elevated circulating IGF-I promotes mammary gland development and proliferation. Endocrinology. 151 (12), 5751-5761 (2010).
- Thompson, C., Rahim, S., Arnold, J., Hielscher, A. Loss of caveolin-1 alters extracellular matrix protein expression and ductal architecture in murine mammary glands. PLoS One. 12 (2), 0172067 (2017).
- Williams, C. M., Engler, A. J., Slone, R. D., Galante, L. L., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin expression modulates mammary epithelial cell proliferation during acinar differentiation. Cancer Res. 68 (9), 3185-3192 (2008).
- Krause, S., Brock, A., Ingber, D. E. Intraductal injection for localized drug delivery to the mouse mammary gland. J Vis Exp. (80), (2013).
