Isolierung von intakt, ganze Maus Milchdrüsen zur Analyse der extrazellulären Matrix Ausdruck und Drüse Morphologie
Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Isolierung des gesamten, intakte Maus Milchdrüsen um Ausdruck der extrazellulären Matrix (ECM) und duktale Morphologie zu untersuchen. Maus #4 Bauch-Drüsen wurden von ca. 8-10 Wochen alten weiblichen nulliparous Mäusen, in neutral gepuffertem Formalin fixiert, geschnitten und gefärbt mit Immunohistochemistry für ECM Proteine extrahiert.
Abstract
Das Ziel dieses Verfahrens war #4 Bauch Milchdrüsen von weiblichen nulliparous Mäusen zu ernten, um ECM Ausdruck und duktale Architektur zu beurteilen. Hier entstand eine kleine Tasche unter der Haut mit Mayo Schere, so dass Trennung der Drüsen in das subkutane Gewebe von der zugrunde liegenden Bauchfell. Visualisierung der Drüsen wurde unterstützt durch den Einsatz von 3,5 X-R chirurgische micro Lupen. Das Fell wurde invertiert und merken zurück ermöglicht Identifikation von intakten Mamma Fettpolster. Jeder der #4 Bauch-Drüsen wurde unverblümt zergliedert durch Verschieben der Skalpellklinge seitlich zwischen die subkutane Schicht und die Drüsen. Sofort nach der Ernte, wurden die Drüsen in 10 % neutral gepuffertem Formalin für die anschließende Gewebe Verarbeitung gelegt. Exzision der gesamten Drüse ist vorteilhaft, weil es in erster Linie eliminiert das Risiko des Ausschlusses wichtiger Gewebe-weite Wechselwirkungen zwischen duktalen Epithelzellen und andere microenvironmental zellularen Bevölkerungen, die in einer partiellen Biopsie entgehen lassen könnte. Ein Nachteil der Methode ist die Verwendung von Schnittserien aus festen Geweben die Analysen des duktalen Morphogenese und Protein Ausdruck an diskreten stellen innerhalb der Drüse begrenzt. Als solche Veränderungen in duktale Architektur und Protein-Expression in 3 Dimensionen (3D) ist nicht leicht erhältlich. Alles in allem ist die Technik auf Studien, die völlig intakt murinen Milchdrüsen für nachgelagerte Untersuchungen wie Entwicklungsstörungen duktale Morphogenese oder Brust Krebs anwendbar.
Introduction
Brustkrebs ist gekennzeichnet durch ein hohes Maß an Gewebe Fibrose1,2,3,4. Als die ECM bezeichnet, diese nicht-zelluläre Einheit findet sich in unterschiedlichem Ausmaß in allen Geweben und besteht hauptsächlich aus einem komplexen Geflecht von fibrillären und nicht-fibrillären Kollagene, Elastin und Glykoproteinen neben verschiedenen Signalmoleküle, die in dieser Matrix abgesondert. Homöostatische Bedingungen wird die Ablagerung und den Abbau des ECM streng kontrolliert. 5 während Brust Tumorgenese, wird das Gleichgewicht der ECM-Ablagerung und Abbau gestört. Als solche wurden Brusttumoren berichtet, reichlich ECM-Proteine wie Kollagene, Fibronektin und Tenascin-C unter anderem zum Ausdruck bringen. 6 der abnorme Ausdruck dieser Proteine zusätzlich erhöhte Muster Matrix Vernetzungsgrad ist dokumentiert worden, zur Förderung der Brust Tumor Progression, Metastasierung und Therapie Widerstand1,3, 4,7,8,9.
Um ECM Zusammensetzung und duktale Morphologie zu beurteilen, wurde Isolation intakt Milchdrüsen durchgeführt. Hier wir weibliche nulliparous Mäusen unzulänglich für Caveolin-1 verwendet, eine integrale Membranprotein, verbunden mit einer aggressiven Brustkrebs-Tumor Signatur10,11,12, und weibliche nulliparous B6 zu kontrollieren Mäuse. Histologischen Verarbeitung und Färbung dieser Gewebe erlaubt die Identifizierung von mehreren ECM-Proteinen zusammen mit Charakterisierung von duktalen Morphologie.
Alles in allem Möglichkeit die Isolierung des gesamten, intakte Milchdrüsen Forscher die, Gewebe-weite morphologische oder zelluläre Veränderungen in Reaktion auf exogene oder endogene Faktoren zu untersuchen. Nachteile der Technik sind verbunden mit Analysen von 2 Dimension (2D) Gewebeschnitte im Gegensatz zu einer 3D Perspektive, die ein vollständigeres Bild der komplexen Morphologie des Baumes duktale erbringen würde. Angesichts der Komplexität der Zell-Zell und Zelle-ECM-Interaktionen, die stattfinden in der Brustdrüse, ist die Isolierung des gesamten, intakten Drüsen vorteilhaft für effizient analysieren duktale Morphologie und Protein Ausdruck in verschiedenen Regionen der Murine Milch- Drüse.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dem Papier haben wir eine Technik, um intakte Maus Milchdrüsen für nachgeschaltete histologische Analysen der ECM Ausdruck und duktale Morphologie isolieren beschrieben. Im Hinblick auf Analysen von duktalen Morphologie ermöglicht diese Methode die rasche Untersuchung der duktalen Architektur basiert auf gefärbten histologischen Abschnitte. Andere Methoden des duktalen Analysen beruhen auf Injektionen von Farbstoffen ermöglicht Visualisierung des Baumes duktale Methoden die technisch schwierig und zeitraubend sei…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten April Wiles und Dr. Roger Broderson für Hilfe mit tierischen Sektions- und Drüse Isolation, bzw. zu bestätigen. Mittel für diese Arbeit wurde von den Philadelphia College of Osteopathic Medicine Centers für chronische Erkrankungen des Alterns unterstützt.
Materials
| Light Microscope | Olympus | BX43 | |
| Microscope Camera | Olympus | DP73 | |
| Image Analysis Software | Olympus | cellSens Entry software | |
| NIH | ImageJ | ||
| 3.5x-R Surgical Micro Loupes | Rose Micro Solutions | Magnification at researcher's preference | |
| Mayo Scissors | Medline | DYND04035 | |
| Staining Rack | Fisher Scientific | 121 | |
| Staining Dish | Fisher Scientific | 112 | |
| Coplin Jars | Fisher Scientific | 19-4 | |
| Glass coverslips | Fisher Scientific | 12-550-15 | Size appropriate for tissue |
| IHC EnVision+ Kit (HRP, Mouse, DAB+) | Dako | K400611-2 | |
| Picrosirius Red Kit | Abcam | AB150681 | |
| Eosin Y, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110132 | |
| Harris Hematoxylin | Sigma-Aldrich | HHS16 | |
| Donkey Serum | EMD Millipore | S30 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Xylenes, Reagent Grade | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Ethanol, 200 proof | Sigma-Aldrich | 792780 | suitable for molecular biology |
| Phosphate Buffered Saline, 1x | Gibco | 10010023 | |
| Sodium Citrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Calcium Carbonate | Sigma-Aldrich | 202932 | |
| Permanent Mounting Medium | Dako | S1964 | |
| Eukitt's Mounting Medium | Sigma-Aldrich | 3989 | |
| Fibronectin antibody | Abcam | AB23750 | |
| Tenascin-C antibody | Abcam | AB108930 | |
| Alpha Smooth Muscle Actin antibody | Abcam | AB124964 | |
| Dako Envision Dual Link System HRP | Dako | K4065 |
Referências
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