Lens-gratis videomicroscopie voor de dynamiek en de kwantitatieve analyse van aanhangend celkweek
Summary
Lens-vrije videomicroscopie ons in staat stelt om te controleren van celculturen direct in de incubator. Hier beschrijven we het volledige protocol gebruikt voor het verwerven en analyseren van een 2.7 dag lang verwerving van gekweekte HeLa cellen, wat leidt tot een dataset van 2.2 x 106 metingen van individuele cel morfologie en 10584 celcyclus tracks.
Abstract
Hier, wij tonen die lens-gratis video microscopie laat ons tegelijkertijd vastleggen de kinetiek van duizenden cellen rechtstreeks binnen de incubator en dat het mogelijk is om te controleren en te kwantificeren van afzonderlijke cellen langs verschillende cel cycli. We beschrijven de volledige protocol dat wordt gebruikt om te controleren en te kwantificeren van een celkweek van HeLa 2.7 dagenlang. Eerst, cel cultuur overname is uitgevoerd met een lens-gratis video Microscoop, en vervolgens de gegevens wordt geanalyseerd na een proces van vier stappen: multi golflengte holografische wederopbouw, cel-tracking, mobiele segmentatie en celdeling detectie algoritmen. Dientengevolge, laten we zien dat het mogelijk is te verzamelen een dataset met meer dan 10.000 celcyclus tracks en meer dan 2 x 106 cel morfologische metingen.
Introduction
Monitoring van gekweekte zoogdiercellen in heel verschillende cel cycli en nauwkeurig meten cel grootte en cel drooggewicht is een uitdagende taak. Verschillende label-vrije optische technieken kunnen uitvoeren van deze taak1,2: fase-verschuiving interferometrie3, digitale holografische microscopie (DHM)4,5,6, 7, quadriwave laterale schuintrekken interferometrie8,9 en kwantitatieve fase tomografie10,11. Deze methoden hebben geleid tot veel nieuwe inzichten in het begrijpen van de celcyclus van zoogdiercellen. Maar zij worden zelden in combinatie met automatische cel bijhouden van algoritmen en hun doorvoer beperkt blijft bij het meten van massa trajecten1 cel (N < 20 in respectievelijk3,4,5 , 6). Vandaar een nieuwe optische methode voor het meten van de massa trajecten cel met grote statistieken nodig is (N > 1000).
In dit document tonen wij de mogelijkheden van de lens-vrije videomicroscopie voor gelijktijdig beeld duizenden cellen rechtstreeks binnen de incubator, en vervolgens het kwantificeren van eencellige statistieken langs duizenden individuele cel fietspaden. Lens-vrije microscopie is een kwantitatieve fase imaging techniek waarmee de overname van fase beeld van dichtbevolkte verpakte cellen over een zeer groot gezichtsveld (meestal enkele tientallen mm2, hier 29,4 mm2)12,13 ,14,15. Diverse maatstelsels op het niveau van één cel worden bepaald, bijvoorbeeldcel gebied, cel drooggewicht, cel dikte, lengte van de hoofdas cellen en cel hoogte-/ breedteverhouding12,15, van elke afbeelding. Vervolgens, door toepassing van een algoritme cel-tracking, deze functies kunnen worden uitgezet voor iedere enkele cel als functie van het experiment tijd14,15. Bovendien, door het detecteren van de aanwezigheid van celdelingen in de cel nummers, het is mogelijk om uit te pakken van andere belangrijke informatie, zoals de eerste cel droge massa (net na de celdeling), de laatste cel drooggewicht (net voor de afdeling van de cel) en de cel cyclus duur, dat wil zeggen, de tijd tussen twee opeenvolgende divisies15. Alle deze metingen kunnen worden berekend met zeer goede statistieken (N > 1000) Aangezien het groot gezichtsveld zou meestal de analyse van 200 naar 10000 cellen in een enkele lens-gratis overname.
Om uit te leggen deze methode gebaseerd op de lens-vrije videomicroscopie, beschrijven we het protocol om te controleren en te kwantificeren van een celkweek van HeLa 2.7 dagenlang. Data-analyse is een vier-stappen-proces op basis van multi golflengte holografische wederopbouw, cel-tracking, mobiele segmentatie en celdeling algoritmen. Hier wordt aangetoond dat de ruimtelijke resolutie en de relatief snelle framerate (een acquisitie om de 10 minuten) verkregen met deze lens-vrije videomicroscopie setup compatibel met standaard cel-tracking algoritmen. De volledige analyse van deze dataset resulteert in de meting van 10,584 cel nummers over volledige cel cycli.
Om samen te vatten, is lens-vrije videomicroscopie een krachtig hulpmiddel voor het automatisch controleren van duizenden labelloze, niet-gesynchroniseerde en ongewijzigde cellen per experiment; elke cel wordt bijgehouden over meerdere cel cycli. Onze metingen bieden dus de gemiddelde waarde van verschillende parameters van de cel, maar nog belangrijker, de variabiliteit van Inter cel over een grote bevolking van cellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In deze paper, laten we zien dat lens-vrije videomicroscopie binnen een incubator te vangen de kinetiek van duizenden cellen kan worden gebruikt. Om de algemene methodologie beschrijven we uitgelegd hoe een time-lapse verwerving van 2.7 dag van HeLa cellen in cultuur kan worden geanalyseerd met standaard cel-tracking algoritmen. Het resultaat is een dataset met 2.2 x 106 cel metingen en 10,584 tracks van de celcyclus. De acquisities werden uitgevoerd op een cultuur van Hela cellen met een relatief grote afstan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs hebben niets te erkennen.
Materials
| Cytonote lens-free video microscope | Iprasense | ||
| Horus acquisition software | Iprasense | ||
| 6-well glass bottom culture plates | MatTek corporation | Part No: P06G-0-14-F | |
| DMEM + GlutaMAX medium | Gibco | ||
| heat-inactivated fetal calf serum | Eurobio | ||
| penicillin and streptomycin | Gibco | ||
| Fibronectin | Sigma Aldrich | ||
| Matlab, image processing toolbox | Mathworks |
References
- Zangle, T. A., Teitell, M. A. Live-cell mass profiling: an emerging approach in quantitative biophysics. Nat Methods. 11 (12), 1221-1228 (2014).
- Popescu, G., Park, K., Mir, M., Bashir, R. New technologies for measuring single cell mass. Lab Chip. 14 (4), 646-652 (2014).
- Reed, J., et al. Rapid, massively parallel single-cell drug response measurements via live cell interferometry. Biophys J. 101 (5), 1025-1031 (2011).
- Mir, M., et al. Optical measurement of cycle-dependent cell growth. Proc Natl Acad Sci. USA. 108 (32), 13124-13129 (2011).
- Girshovitz, P., Shaked, N. T. Generalized cell morphological parameters based on interferometric phase microscopy and their application to cell life cycle characterization. Biomed Opt Express. 3 (8), 1757-1773 (2012).
- Kemper, B., Bauwens, A., Vollmer, A., Ketelhut, S., Langehanenberg, P. Label-free quantitative cell division monitoring of endothelial cells by digital holographic microscopy. J Biomed Opt. 15 (3), (2010).
- Mir, M., Bergamaschi, A., Katzenellenbogen, B. S., Popescu, G. Highly sensitive quantitative imaging for monitoring single cancer cell growth kinetics and drug response. PLoS One. 9 (2), 1-8 (2014).
- Bon, P., Savatier, J., Merlin, M., Wattellier, B., Monneret, S. Optical detection and measurement of living cell morphometric features with single-shot quantitative phase microscopy. J Biomed Opt. 17 (7), (2012).
- Aknoun, S., et al. Living cell dry mass measurement usinq quantitative phase imaging with quadriwave lateral shearing interferometry: an accuracy and sensitivity discussion. J Biomed Opt. 20 (1), 1-4 (2015).
- Cotte, Y., et al. Marker-free phase nanoscopy. Nature Photonics. 7 (2), 113-117 (2013).
- Choi, W., et al. Tomographic phase microscopy. Nat Methods. 4 (9), 717-719 (2007).
- Kesavan, S. V., et al. High-throughput monitoring of major cell functions by means of lensfree video microscopy. Sci Rep. 4, 1-11 (2014).
- Zheng, G., Lee, S. A., Antebi, Y., Elowitz, M. B., Yang, C. The ePetri dish, an on-chip cell imaging platform based on subpixel perspective sweeping microscopy (SPSM). Proc Natl Acad Sci USA. 108 (41), 16889-16894 (2011).
- Pushkarsky, I., et al. Automated single-cell motility analysis on a chip using lensfree microscopy. Sci Rep. 4, 4717 (2014).
- Allier, C., et al. Imaging of dense cell cultures by multiwavelength lens-free video microscopy. Cytom Part A. 91 (5), 1-10 (2017).
- Su, T. -. W., Seo, S., Erlinger, A., Ozcan, A. High-throughput lensfree imaging and characterization of a heterogeneous cell solution on a chip. Biotechnol Bioeng. 102 (3), 856-868 (2009).
- Delacroix, R., et al. Cerebrospinal fluid lens-free microscopy: a new tool for the laboratory diagnosis of meningitis. Sci Rep. 7, 39893 (2017).
- Tinevez, J. -. Y., et al. TrackMate: an open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2016).
- Popescu, G. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am J Physiol Physiol. 295 (2), 538-544 (2008).
- Liu, P. Y., et al. Cell refractive index for cell biology and disease diagnosis: past, present and future. Lab Chip. 16, 634-644 (2016).
- Rapoport, D. H., Becker, T., Mamlouk, A. M., Schicktanz, S., Kruse, C. A novel validation algorithm allows for automated cell tracking and the extraction of biologically meaningful parameters. PLoS One. 6 (11), e27315 (2011).
- Al-Kofahi, O., et al. Automated cell lineage construction: A rapid method to analyze clonal development established with murine neural progenitor cells. Cell Cycle. 5 (3), 327-335 (2006).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I., van Cappellen, W. A. Tracking in cell and developmental biology. Semin Cell Dev Biol. 20 (8), 894-902 (2009).
- Posakony, J. W., England, J. M., Attardi, G. Mitochondrial growth and division during the cell cycle in HeLa cells. J Cell Biol. 74 (2), 468-491 (1977).
- Zocchi, E., et al. Expression of CD38 Increases Intracellular Calcium Concentration and Reduces Doubling Time in HeLa and 3T3 Cells. J Biol Chem. 273 (14), 8017-8024 (1979).
- Reitzer, L. J., Wice, B. M., Kennell, D. Evidence that glutamine, not sugar, is the major energy source for cultured HeLa cells. J Biol Chem. 254 (8), 2669-2676 (1979).
- Benedetti, A. D. E., Joshi-barve, S., Rinker-Schaeffer, C., Rhoads, R. E. Expression of Antisense RNA against Initiation Factor eIF-4E mRNA in HeLa Cells Results in Lengthened Cell Division Times, Diminished Translation Rates, and Reduced Levels of Both eIF-4E and the p220 Component of eIF-4F. Mol Cell Biol. 11 (11), 5435-5445 (1991).
- Kumei, Y., Nakajima, T., Sato, A., Kamata, N., Enomoto, S. Reduction of G1 phase duration and enhancement of c-myc gene expression in HeLa cells at hypergravity. J Cell Sci. 93 (2), 221-226 (1989).
- Ginzberg, M. B., Kafri, R., Kirschner, M. On being the right (cell) size. Science. 348 (6236), 1245075 (2015).
- Mathieu, E., et al. Time-lapse lens-free imaging of cell migration in diverse physical microenvironments. Lab Chip. 16 (17), 3304-3316 (2016).
