Lente libre Video microscopia para la dinámica y el análisis cuantitativo del cultivo de células adherentes
Summary
Microscopía lente libre de vídeo nos permite supervisar cultivos celulares directamente dentro de la incubadora. Aquí describimos el protocolo completo utilizado para adquirir y analizar una adquisición largo 2,7 días de cultivos de células HeLa, conduce a un conjunto de datos de 2.2 x 106 mediciones de morfología de la célula individual y ciclo celular 10584 pistas.
Abstract
Aquí, demostramos que video gratis lente microscopía nos permite capturar simultáneamente la cinética de miles de células directamente dentro de la incubadora y que es posible supervisar y cuantificar las células a lo largo de varios ciclos de la célula. Describimos el protocolo completo usado para monitorear y cuantificar un cultivo celular HeLa de 2,7 días. En primer lugar, se realiza adquisición de cultura de célula con un microscopio de lente-libre de vídeo, y luego los datos son analizados siguiendo un proceso de cuatro pasos: detección de segmentación y división celular de celular rastreo de celular, reconstrucción holográfica de la multi-longitud de onda, algoritmos. Como resultado, mostramos que es posible reunir un conjunto de datos cuenta con más de 10.000 pistas de ciclo celular y las mediciones de más de 2 x 106 células morfológica.
Introduction
Monitoreo de células de mamíferos cultivadas a lo largo de varios ciclos de la célula y medir con precisión la célula tamaño y célula masa seca es una tarea difícil. Varias técnicas de etiqueta-libre ópticas son capaces de realizar esta tarea1,2: desfasaje interferometría3, microscopia holográfica digital (DHM)4,5,6, 7, quadriwave lateral corte interferometría8,9 y fase cuantitativa tomografía10,11. Estos métodos han conducido a muchas nuevas perspectivas en la comprensión del ciclo celular de células de mamíferos. Sin embargo rara vez se juntan con algoritmos de seguimiento automático de la célula y su rendimiento sigue siendo limitada cuando medición de células trayectorias masa1 (N < 20 respectivamente3,4,5 , 6). por lo tanto es necesario un novedoso método óptico para medir trayectorias masa celular con estadísticas grandes (N > 1000).
En este trabajo demostramos la capacidad de microscopía lente libre de vídeo imagen simultáneamente miles de células directamente dentro de la incubadora, y luego cuantificar métricas de unicelular a lo largo de miles de pistas de cada ciclo celular. Lente libre la microscopia es una fase cuantitativa, técnica que permite la adquisición de la imagen de la fase de células densamente sobre un gran campo de visión de la proyección de imagen (normalmente varias decenas de mm2, aquí 29,4 mm2)12,13 ,14,15. Se determinan varias métricas a nivel unicelular, por ejemplo, área de la célula, celular de masa seca, espesor de célula, célula eje mayor longitud y proporción12,15, de cada imagen de la célula. Luego, mediante la aplicación de un algoritmo de seguimiento de la célula, se pueden trazar estas características para cada célula individual en función del experimento tiempo14,15. Además, mediante la detección de la ocurrencia de divisiones celulares en las pistas de la célula, es posible extraer información importante tales como la celda inicial seca masa (justo después de la división de célula), la masa seca de la célula final (justo antes de la división de célula) y la célula ciclo de duración, es decir, el tiempo entre dos divisiones consecutivas15. Todas estas mediciones se pueden computar con muy buenas estadísticas (N > 1000) ya que el gran campo de visión por lo general permitiría el análisis de 200 a 10.000 células en una sola adquisición libre de lentes.
Para explicar esta metodología basada en microscopía lente libre de vídeo, se describe el protocolo para controlar y cuantificar un cultivo celular HeLa de 2,7 días. Análisis de datos es un proceso de cuatro pasos, basado en reconstrucción holográfica de la multi-longitud de onda, seguimiento de células, segmentación de la célula y algoritmos de la división celular. Aquí se demuestra que la resolución espacial y la velocidad de fotogramas relativamente rápido (una adquisición cada 10 minutos) con esta configuración de microscopía lente libre de vídeo es compatible con estándar algoritmos de seguimiento de la célula. El análisis completo de este conjunto de resultados en la medición de 10.584 celular pistas sobre ciclos celulares completos.
Para resumir, microscopía lente libre de vídeo es una herramienta poderosa para monitorizar automáticamente miles de sincronización, sin etiqueta y sin modificar las células por experimento; cada célula rastrean varios ciclos de la célula. Nuestras mediciones ofrecen el valor medio de varios parámetros de la celda, pero más importante aún, la variabilidad inter-célula sobre una gran población de células.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este trabajo, mostramos que microscopía lente libre de vídeo puede utilizarse dentro de una incubadora para capturar la cinética de miles de células. Para describir la metodología global nos explicó cómo una adquisición de Time-lapse de 2,7 días de células HeLa en cultura puede ser analizada con algoritmos estándar de seguimiento de la célula. El resultado es un conjunto de datos con 2,2 x 106 células medidas y 10.584 pistas de ciclo celular. Las adquisiciones se realizaron en un cultivo de cé…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores no tienen nada que agradecer.
Materials
| Cytonote lens-free video microscope | Iprasense | ||
| Horus acquisition software | Iprasense | ||
| 6-well glass bottom culture plates | MatTek corporation | Part No: P06G-0-14-F | |
| DMEM + GlutaMAX medium | Gibco | ||
| heat-inactivated fetal calf serum | Eurobio | ||
| penicillin and streptomycin | Gibco | ||
| Fibronectin | Sigma Aldrich | ||
| Matlab, image processing toolbox | Mathworks |
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