Объектив Бесплатные видео микроскопии для динамического и количественный анализ культуры адэрентных клеток
Summary
Объектив Бесплатные видео микроскопии позволяет нам контролировать клеточных культур непосредственно внутри инкубатора. Здесь мы описываем полный протокол, используемый для приобретения и анализировать 2,7 дня приобретения культивируемых клеток HeLa, ведущих к dataset 2,2 х 106 измерения отдельных клеток морфологии и 10584 клеточного цикла треков.
Abstract
Здесь мы показываем, что объектив Бесплатные видео микроскопии позволяет нам одновременно захватить кинетика тысяч клеток непосредственно внутри инкубатора, и что это возможно для мониторинга и количественной оценки одиночных клеток вдоль нескольких циклов клеток. Мы описываем полный протокол, используемый для мониторинга и количественной оценки культуре клеток HeLa 2.7 дней. Во-первых, приобретение культуры клеток производится с микроскопом объектив Бесплатные видео, и затем данные анализируются следующие четыре этапа: мульти волны голографической реконструкции, клетки слежения, клетки сегментации и деление клеток обнаружения алгоритмы. В результате мы покажем, что это возможно собрать dataset с участием более чем 10000 клеточного цикла треков и более чем 2 х 106 клеток морфологических измерений.
Introduction
Мониторинга культивируемых клеток млекопитающих на протяжении нескольких циклов клеток и точного измерения ячеек размер и клетки сухой массы является сложной задачей. Несколько лейбл бесплатно оптические методы могут выполнять эту задачу1,2: фазосдвигающие интерферометрии3, голографические цифровой микроскопии (DHM)4,5,6, 7, quadriwave боковой наклон интерферометрии8,9 и количественную фазу томография10,11. Эти методы привели к многие новые идеи в понимании клеточного цикла mammalian клеток. Однако они редко связаны с автоматической ячейки отслеживания алгоритмов и их пропускная способность остается ограниченным, при измерении ячейки массового траекторий1 (N < 20 соответственно3,4,5 , 6). Следовательно, Роман оптический метод необходим для измерения массы клеток траекторий с большой статистики (N > 1000).
В этой статье мы продемонстрировать способность объектива Бесплатные видео микроскопии одновременно изображения тысячи клеток непосредственно внутри инкубатора, и затем определить метрики одну ячейку вдоль тысячи отдельных клеточного цикла треков. Объектив свободный микроскопии является количественных этап визуализации технику, которая позволяет приобретение фазы изображения плотно упакованных клеток через очень большое поле зрения (обычно несколько десятков мм2, здесь 29,4 мм2)12,13 ,14,15. Определяются несколько метрик на уровне отдельной ячейки, например, ячейка области, клетки сухой массы, клетки толщина, длина главной оси клеток и клеточной пропорции12,15, от каждого изображения. Затем применив алгоритм отслеживания клеток, эти особенности могут быть отображены для каждый single cell как функция время эксперимента,14,,15. Кроме того выявляя возникновение клеточных делений в ячейке треков, можно извлечь другие важные сведения, такие как первоначальная клеточная сухой массы (сразу после деления клетки), окончательный клеточной сухой массы (непосредственно перед деление клеток) и клетки цикла, длительность, то есть, время между двух последовательных подразделений15. Все эти измерения может быть вычислена с очень хорошей статистики (N > 1000) поскольку большое поле зрения обычно позволит анализ 200 до 10 000 ячеек в одной свободной объектив приобретения.
Для того, чтобы объяснить эту методологию, основанную на объектив Бесплатные видео микроскопии, мы описываем протокола для мониторинга и количественной оценки культуре клеток HeLa 2.7 дней. Анализ данных является 4 ступенчатый процесс, основанный на мульти волны голографической реконструкции, отслеживания клеток, клеток сегментации и деление клеток алгоритмов. Здесь показано, что пространственное разрешение и относительно высокой частоте кадров (одно приобретение каждые 10 минут), полученные с этой установки объектива Бесплатные видео микроскопии совместим с стандартных алгоритмов клеток отслеживания. Полный анализ этого набора данных приводит к измерение 10,584 клеток треков на полных цикла клетки.
Подводя итог, объектив Бесплатные видео микроскопии является мощным инструментом автоматически контролировать тысячи неподписанных, несинхронизированные и неизмененной клетки за эксперимент; Каждая ячейка, отслеживается в течение нескольких циклов клеток. Таким образом, наши измерения обеспечивают среднее значение нескольких параметров клеток, но что более важно, между клеток изменчивость над большой популяции клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой статье мы покажем, что объектив Бесплатные видео микроскопии может использоваться внутри инкубатор для захвата кинетика тысяч клеток. Для того чтобы описать общую методологию, мы объяснили, как промежуток времени приобретения 2.7 день клеток HeLa в культуре могут быть проанализиро…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы не имеют ничего подтвердить.
Materials
| Cytonote lens-free video microscope | Iprasense | ||
| Horus acquisition software | Iprasense | ||
| 6-well glass bottom culture plates | MatTek corporation | Part No: P06G-0-14-F | |
| DMEM + GlutaMAX medium | Gibco | ||
| heat-inactivated fetal calf serum | Eurobio | ||
| penicillin and streptomycin | Gibco | ||
| Fibronectin | Sigma Aldrich | ||
| Matlab, image processing toolbox | Mathworks |
References
- Zangle, T. A., Teitell, M. A. Live-cell mass profiling: an emerging approach in quantitative biophysics. Nat Methods. 11 (12), 1221-1228 (2014).
- Popescu, G., Park, K., Mir, M., Bashir, R. New technologies for measuring single cell mass. Lab Chip. 14 (4), 646-652 (2014).
- Reed, J., et al. Rapid, massively parallel single-cell drug response measurements via live cell interferometry. Biophys J. 101 (5), 1025-1031 (2011).
- Mir, M., et al. Optical measurement of cycle-dependent cell growth. Proc Natl Acad Sci. USA. 108 (32), 13124-13129 (2011).
- Girshovitz, P., Shaked, N. T. Generalized cell morphological parameters based on interferometric phase microscopy and their application to cell life cycle characterization. Biomed Opt Express. 3 (8), 1757-1773 (2012).
- Kemper, B., Bauwens, A., Vollmer, A., Ketelhut, S., Langehanenberg, P. Label-free quantitative cell division monitoring of endothelial cells by digital holographic microscopy. J Biomed Opt. 15 (3), (2010).
- Mir, M., Bergamaschi, A., Katzenellenbogen, B. S., Popescu, G. Highly sensitive quantitative imaging for monitoring single cancer cell growth kinetics and drug response. PLoS One. 9 (2), 1-8 (2014).
- Bon, P., Savatier, J., Merlin, M., Wattellier, B., Monneret, S. Optical detection and measurement of living cell morphometric features with single-shot quantitative phase microscopy. J Biomed Opt. 17 (7), (2012).
- Aknoun, S., et al. Living cell dry mass measurement usinq quantitative phase imaging with quadriwave lateral shearing interferometry: an accuracy and sensitivity discussion. J Biomed Opt. 20 (1), 1-4 (2015).
- Cotte, Y., et al. Marker-free phase nanoscopy. Nature Photonics. 7 (2), 113-117 (2013).
- Choi, W., et al. Tomographic phase microscopy. Nat Methods. 4 (9), 717-719 (2007).
- Kesavan, S. V., et al. High-throughput monitoring of major cell functions by means of lensfree video microscopy. Sci Rep. 4, 1-11 (2014).
- Zheng, G., Lee, S. A., Antebi, Y., Elowitz, M. B., Yang, C. The ePetri dish, an on-chip cell imaging platform based on subpixel perspective sweeping microscopy (SPSM). Proc Natl Acad Sci USA. 108 (41), 16889-16894 (2011).
- Pushkarsky, I., et al. Automated single-cell motility analysis on a chip using lensfree microscopy. Sci Rep. 4, 4717 (2014).
- Allier, C., et al. Imaging of dense cell cultures by multiwavelength lens-free video microscopy. Cytom Part A. 91 (5), 1-10 (2017).
- Su, T. -. W., Seo, S., Erlinger, A., Ozcan, A. High-throughput lensfree imaging and characterization of a heterogeneous cell solution on a chip. Biotechnol Bioeng. 102 (3), 856-868 (2009).
- Delacroix, R., et al. Cerebrospinal fluid lens-free microscopy: a new tool for the laboratory diagnosis of meningitis. Sci Rep. 7, 39893 (2017).
- Tinevez, J. -. Y., et al. TrackMate: an open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2016).
- Popescu, G. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am J Physiol Physiol. 295 (2), 538-544 (2008).
- Liu, P. Y., et al. Cell refractive index for cell biology and disease diagnosis: past, present and future. Lab Chip. 16, 634-644 (2016).
- Rapoport, D. H., Becker, T., Mamlouk, A. M., Schicktanz, S., Kruse, C. A novel validation algorithm allows for automated cell tracking and the extraction of biologically meaningful parameters. PLoS One. 6 (11), e27315 (2011).
- Al-Kofahi, O., et al. Automated cell lineage construction: A rapid method to analyze clonal development established with murine neural progenitor cells. Cell Cycle. 5 (3), 327-335 (2006).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I., van Cappellen, W. A. Tracking in cell and developmental biology. Semin Cell Dev Biol. 20 (8), 894-902 (2009).
- Posakony, J. W., England, J. M., Attardi, G. Mitochondrial growth and division during the cell cycle in HeLa cells. J Cell Biol. 74 (2), 468-491 (1977).
- Zocchi, E., et al. Expression of CD38 Increases Intracellular Calcium Concentration and Reduces Doubling Time in HeLa and 3T3 Cells. J Biol Chem. 273 (14), 8017-8024 (1979).
- Reitzer, L. J., Wice, B. M., Kennell, D. Evidence that glutamine, not sugar, is the major energy source for cultured HeLa cells. J Biol Chem. 254 (8), 2669-2676 (1979).
- Benedetti, A. D. E., Joshi-barve, S., Rinker-Schaeffer, C., Rhoads, R. E. Expression of Antisense RNA against Initiation Factor eIF-4E mRNA in HeLa Cells Results in Lengthened Cell Division Times, Diminished Translation Rates, and Reduced Levels of Both eIF-4E and the p220 Component of eIF-4F. Mol Cell Biol. 11 (11), 5435-5445 (1991).
- Kumei, Y., Nakajima, T., Sato, A., Kamata, N., Enomoto, S. Reduction of G1 phase duration and enhancement of c-myc gene expression in HeLa cells at hypergravity. J Cell Sci. 93 (2), 221-226 (1989).
- Ginzberg, M. B., Kafri, R., Kirschner, M. On being the right (cell) size. Science. 348 (6236), 1245075 (2015).
- Mathieu, E., et al. Time-lapse lens-free imaging of cell migration in diverse physical microenvironments. Lab Chip. 16 (17), 3304-3316 (2016).
