Un metodo efficiente In Vitro trasposizione da un sistema di bellezza dormire trascrizionalmente regolata confezionato in un vettore lentivirale difettoso di integrazione

Summary

Questo protocollo descrive un metodo per realizzare l’integrazione stabile di un gene di interesse nel genoma umano di sistema Sleeping Beauty trascrizionalmente regolato. Preparazione dell’integrazione dei vettori lentivirali difettosi, la trasduzione in vitro di cellule umane e l’analisi molecolare sulle cellule trasdotte sono segnalati.

Abstract

Il trasposone Sleeping Beauty (SB) è un sistema di integrazione non virali con provata efficacia per il trasferimento genico e genomica funzionale. Per ottimizzare il macchinario del trasposone SB, un transposase iperattivo trascrizionalmente regolata (SB100X) e basati su T2 trasposone sono impiegati. In genere, la transposase ed i trasposoni sono forniti transitoriamente mediante trasfezione di plasmide e SB100X espressione è guidato da un promotore costitutivo. Qui, descriviamo un metodo efficiente per fornire i componenti di SB a cellule umane che sono resistenti a diversi metodi di transfezione fisiche e chimiche, per controllare l’espressione di SB100X e integrare stabilmente un gene di interesse (GOI) attraverso un SB “taglia e incolla” meccanismo. L’espressione della transposase iperattivo è strettamente controllato dal sistema Tet-ON, ampiamente utilizzato per controllare l’espressione genica dal 1992. Il gene di interesse è affiancato da ripetizioni invertiti (IR) del trasposone T2. Entrambi i componenti SB sono confezionati in integrazione difettosi vettori lentivirali transitoriamente prodotta nelle cellule HEK293T. Le cellule umane, sia linee cellulari o cellule primarie da tessuti umani, sono in vitro transitoriamente trasformata con i vettori virali. Con l’aggiunta di doxiciclina (dox, tetraciclina analogica) nel terreno di coltura, una messa a punto di transposase espressione viene misurata e si traduce in un’integrazione di lunga durata del gene di interesse nel genoma delle cellule trattate. Questo metodo è efficace e applicabile alla linea cellulare (per esempio, celle HeLa) e celle primarie (ad es., keratinocytes umani primari) e rappresenta quindi uno strumento prezioso per ingegneria genetica e trasferimento di geni terapeutici.

Introduction

La transposase SB100X iperattivo accoppiato per il trasposone basati su T2 è già stato utilizzato nel gene preclinici terapia applicazioni^1,2,3, genoma modifiche^4,5, e cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) riprogrammazione^6,7. In genere, i componenti di SB transitoriamente sono forniti dalla transfezione del plasmide e un forte promotore costitutivo unità l’espressione della transposase. Tuttavia, nonostante i miglioramento nuovi metodi di transfezione, consegna del sistema bi-componente rimane una sfida per molte applicazioni. Così, lo sviluppo di un nuovo protocollo di recapito ha interesse aumentante. Oltre a metodi di transfezione per plasmide⁸ e mRNA⁹, consegna virale basato su adenoviral^10,11, adeno-associato virale (AAV)¹², Baculovirus¹³, gammaretroviral¹⁴ e vettori lentivirali¹⁵ è stato proposto in passato. In particolare, il sistema di scelta deve garantire una consegna transitoria dei componenti SB senza integrazione del vettore virale. Tuttavia, l’espressione costitutiva di transposase solleva preoccupazioni di sicurezza a causa del rischio di rehopping incontrollabile del trasposone.

Pertanto, la regolazione trascrizionale di SB100X da un raffinato sistema di Tet-ON è la prima sfida. Un promotore di Tet-sensible a reagire modificato, ottenuto sostituendo il promotore originale sviluppato minimale del citomegalovirus (CMV) con il promotore minimo (-81) del gene timidina chinasi (TK) dell’Herpes Simplex Virus-1 (HSV-1)¹⁶, viene duplicato a Monte della SB100X cDNA (pTetOTKSB100X). Il mutato inverso-tetraciclina-transactivator rtTA2^s-M2¹⁷ è espresso sotto il controllo del promotore costitutivo forte (fosfoglicerato promotore, PGK) clonato in un plasmide differente (pCCL-PGKrtTA2^S-M2). Quando aggiunto al terreno di coltura, dox associa il rtTA2^s-modulatore M2 e attacchi il promotore di Tet complesso o, con conseguente induzione strettamente regolato di SB100X espressione¹⁸.

La seconda grande sfida deriva dalla inefficiente transfezione di cellule primarie umane da diversi metodi fisici e chimici. Per distribuire in modo efficiente transposase in cellule umane resistenti di transfezione, il SB100X e il rtTA2^s-cassette espressione M2 sono confezionati in due integrazione vettori lentivirali difettoso (IDLVs)¹⁹: IDLVTKSB e IDLVrtTA2^s– M2. Vettori virali transitoriamente sono prodotte come vettori di generazione terzi HEK293T cellule²⁰ e pseudotipizzato con la glicoproteina G del Virus della stomatite vescicolare (VSV-G), che conferisce un ampio spettro di infezione. Particelle di vettore sono concentrate mediante ultracentrifugazione e titolate di Gag di HIV-1 p24 immunocapture. Per trasdurre linee cellulari e cellule primarie, vettore particelle complessate con polybrene e vengono incubate con cellule bersaglio in presenza o assenza di dox. Droga-dipendente l’attivazione dell’espressione di SB100X in cellule trasdotte è misurata dal quantitativo di RT-PCR (qRT-PCR)¹⁸.

Una volta è dimostrato Tet-regolata SB100X espressione, recepimento del GOI (ad es., proteina fluorescente verde, GFP) nel genoma della cellula bersaglio segue gli eventi molecolari chiaramente schematizzati di Bak e Mikkelsen²¹. Un terzo IDLV di vettore che trasportano una cassetta di espressione per il GOI clonato tra l’IRs T2-trasposoni (IDLVT2) deve essere costruito e confezionato come accennato in precedenza. Infine, i tre vettori IDLV possono essere utilizzati in modo efficiente trasdurre cellule umane (ad es., keratinocytes primari) in vitro e integrare il GOI in presenza di doxiciclina¹⁸.

Protocol

1. plasmidi impiegati Nota: Plasmide pCCL-PGKrtTA2S-M2 è stato gentilmente fornito dalla Prof. ssa Zappavigna (Università di Modena e Reggio Emilia, Modena, Italia). Il plasmide pCMVSB100X portando la sequenza codificante di transposase iperattivo e pT2/BH trasposone plasmide sono state gentilmente concesse dal Prof Z. Ivics (Paul Ehrlich Institute, Langen, Germania) e Prof. ssa Z. Izvak (centro di Max Delbrück per la medicina molecolare, Berlino, Germania). Per tutta l…

Representative Results

Utilizzando la procedura presentata qui, tre vettori IDLV che trasportano i componenti SB regolamentati (SB100X, rtTA2S-trasposone M2 e T2-GFP) erano confezionati e utilizzato per distribuire in modo efficiente e strettamente regolare il sistema di SB in cellule umane. Figura 1A Mostra un schema per in vitro trasduzione delle cellule HeLa, che è stata eseguita per valutare la regolazione trascrizionale di SB transposase con la migliore co…

Discussion

Qui, descriviamo una metodologia ampiamente accessibile per integrare stabilmente un GOI nel genoma delle cellule bersaglio di Sleeping Beauty-mediata di recepimento. Anche se il sistema di SB è stato sviluppato per fornire un metodo nonviral per l’editing genomico, consegna efficiente dei macchinari integrazione (permettono e T2 trasposone) è obbligatoria. Quindi, per utilizzare il sistema di SB su quasi transfectable cellule primarie, una consegna virale dei componenti SB è stata perseguita in questi anni<s…

Materials

Dulbecco’s modified Eagle’s medium with 4.5g/L glucose w/o L-Glutamine	Lonza	BE12-614F	Cell culture medium.
HyClone Fetal Bovine Serum (U.S.), Characterized	GE Healthcare Life Sciences	SH30071.03	Serum used HEK293T cell culture for lentiviral particle production.
Penicillin 10.000 UI/ml Streptomycin 10.000 UI/ml	Lonza	DE17-602E	Reagents for cell culture medium.
L-Glutamine 200mM	Lonza	BE17-605E	Reagent for cell culture medium.
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	Reagent for HBS 2X preparation.
HEPES Buffer, 1M Stock in normal saline	Lonza	BE17-737E	Reagent for HBS 2X preparation.
Disodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4·2H2O), 99.5%	Merck	106580	Reagent for HBS 2X preparation.
Hydrochloric acid – ACS reagent 37% (HCl)	Sigma-Aldrich	320331	Reagent for HBS 2X preparation.
Sterile water for injection	Fresenius Kabi	–	Reagent for HBS 2X preparation.
0.45 µm PESS filter	Whatman	10462100	Filters used to remove cell debris from viral supernatant.
Polyallomer Beckman tubes	Beckman Coulter	326823	Tubes for concentrating IDLV vectors by ultracentrifugation.
PBS-1X w/o Ca, Mg	Lonza	BE17-516F	Buffer for cell wash and lentiviral particle resuspension.
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153	(Optional) Buffer for lentiviral particle resuspension.
HIV-1 Gag p24 immunocapture kit	Perkin Elmer	NEK50001KT	Kit for IDLV particle titration.
Polybrene	Sigma-Aldrich	107689	Reagent to enhance transduction efficiency.
Trypsin (10X) 2.5% in HBSS w/o Ca, Mg	GIBCO	BE17-160E	Reagent to detach HeLa cells (stock solution, to be diluted).
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA)	100938B	AnalaR BDH	Reagent for trypsin working solution preparation.
0.5% Trypsin-EDTA, no phenol red (10X)	GIBCO	15400-054	Reagent to detach keratinocytes (stock solution, to be diluted).
Donor Bovine Serum, New Zealand Origin	GIBCO	16030-074	Serum for Swiss mouse 3T3-J2 cell culture (feeder layer).
Ham’s F12 media	GIBCO	21765	Medium for keratinocytes.
Fetal bovine serum	Lonza	DE14-801F	Serum for HeLa cell culture medium.
Fetal Bovine Serum, qualified, Australia Origin	GIBCO	10099-141	Serum for human primary keratinocyte culture medium.
Insulin from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	I5500	Reagents for keratinocyte growth.
Adenine	VWR	1152-25	Reagents for keratinocyte growth.
Hydrocortisone	VWR	3867-1	Reagents for keratinocyte growth.
Cholera Toxin from Vibrio cholerae	Sigma-Aldrich	C8052	Reagents for keratinocyte growth.
Triiodothyronine	Sigma-Aldrich	T5516	Reagents for keratinocyte growth.
Human EGF	Austral Biological	GF-010-9	Reagents for keratinocyte growth.
Mouse monoclonal APC-conjugated Anti-Feeder antibody	Miltenyi Biotech	130-096-099	To label feeder layer.
RNeasy Plus Mini Kit	Qiagen	74134	RNA purification kit.
SuperScript III Reverse Transcriptase	Life Technologies	18080051	Reverse transcriptase kit.
Deoxynucleotide Mix, 10 mM (dNTP)	Sigma-Aldrich	D7295	Reagent for semi-quantitative PCR.
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	(any)	–	Reagent for semi-quantitative PCR and for qRT-PCR.
GoTaq G2 Hot Start Polymerase	Promega	M740B	Taq polymerase.
Agarose, for molecular biology	Sigma-Aldrich	A9539	Reagent for agarose gel electrophoresis.
UltraPure TBE Buffer, 10X	Invitrogen	15581028	Reagent for agarose gel electrophoresis, to be dilute (1X) in ddH2O.
Ethidium bromide	Sigma-Aldrich	E1510	Reagent for agarose gel electrophoresis.
Doxycycline	Sigma-Aldrich	D-9891	drug to induce transposase expression in HeLa cells and in keratinocytes
TaqMan Universal PCR Master Mix	Applied Biosystem	4304437	TaqMan Universal PCR Master Mix including primers and probe.
15mL High Clarity polypropylene Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, Sterile	Falcon Corning	352096	Tubes for cell collection and vector dilution preparation.
150 mm TC-Treated Cell Culture Dish with 20 mm Grid, Sterile	Falcon Corning	353025	Cell culture dish for viral production.
6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid, Individually Wrapped, Sterile	Falcon Corning	353046	Cell culture plate for HeLa and human primary keratinocyte transduction.
Safe-Lock microcentrifuge tubes, volume 1.5 mL	Eppendorf	0030 120.086	Tubes for dilution preparation.
Safe-Lock microcentrifuge tubes, volume 2 mL	Eppendorf	0030 120.094	Tubes for dilution preparation.
0.2ml PCR Tubes with flat caps, RNase, DNase, DNA and PCR Inhibitor free	(any)	–	Tubes for semi-quantitative PCR.
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL	Applied Biosystem	4346906	96-well for qRT-PCR.
5mL Round Bottom Polystyrene Tube, without Cap	BD Falcon	352052	Tubes for flow cytometry acquisition.
Disposable Serological Pipets, Polystyrene, Individually Wrapped, Sterile (different volumes)	(any)	–	Pipettes for sterile tissue culture applications.
Filter Tips, Sterile, and RNase, DNase, DNA and Pyrogen free (different volumes)	(any)	–	Filter tips for sterile tissue colture and molecular biology applications.
pH meter	(any)	–	Equipment for measurement of HBS 2X pH.
PCR Thermal cycler	(any)	–	Equipment for semi-quantitative PCR.
Agarose gel electrophoresis equipment	(any)	–	Equipment for agarose gel electrophoresis of semi-quantitative PCR.
BD FACS Canto II 2LSR 4/2	BD	–	Flow cytometer.
7900HT Fast Real-Time PCR system	Applied Biosystem	7900HT	Equipment for qRT-PCR.
Benchtop centrifuges for efficient sample processing in cell culture applications, refrigerated, with microplate buckets.	(any)	–	Centrifuge for cell culture processing and spinoculation.
Optima L-90K Ultracentrifuge equipped with SW32TI rotor	Beckman Coulter	–	Ultracentrifuge for lentiviral particle production.
Equipment for cell culture and molecular biology laboratory (e.g., Class II laminar flow hood designed for work involving BSL2 materials, cell culture incubator,refrigerators and freezers (+4 °C, -20 °C, -80 °C), micropipettes and pipet-aid).
Protective laboratory coats, gloves, face protection in accordance with Institute rules and regulations, in particular for lentiviral particle production and transduction.