Эффективным в Vitro транспонирования метод транскрипционно регулируемых Спящая красоты системой упакованы в дефектных лентивирусные вектор интеграции
Summary
Этот протокол описывает метод для достижения стабильной интеграции гена интереса в геноме человека транскрипционно регулируемой системой Спящая красавица . Как сообщается, подготовка интеграции дефектных лентивирусные векторы, трансдукция в пробирке клеток человека и молекулярного анализа на transduced клетки.
Abstract
Спящая красавица (SB) transposon система-вирусных интеграции с доказанной эффективностью для переноса генов и функциональной геномики. Для оптимизации механизма transposon SB, заняты транскрипционно регулируемых гиперактивный Транспозаза (SB100X) и на основе T2 transposon. Как правило Транспозаза и transposon плазмиды transfection временно предоставляются и SB100X выражение определяется учредительными промоутер. Здесь мы описываем эффективный метод для доставки компонентов SB для клеток человека, которые устойчивы к несколько методов трансфекции физические и химические, контролировать выражение SB100X и стабильно интегрировать ген интереса (ГОИ) через «вырезать и вставить» SB механизма. Выражение гиперактивный Транспозаза жестко контролируется системой тет-ON, широко используется для управления экспрессии генов с 1992 года. Гена интереса в окружении Перевернутый повторяется (IR) T2 transposon. Оба компонента SB упакованы в интеграции дефектных лентивирусные векторы временно производится в HEK293T клетках. Клетки человека, линии клетки или клетки первичной из тканей человека, находятся в vitro временно преобразованы с вирусных векторов. После добавления доксициклин (dox, тетрациклин аналоговый) в питательной среды доработки Транспозаза выражение измеряется и приводит длинный длительный интеграции гена интереса в геноме клеток лечение. Этот метод является эффективным и применимым к клеточной линии (например, клетки HeLa) и главные ячейки (например, человека первичной кератиноцитов) и таким образом представляет собой ценный инструмент для генной инженерии и передача терапевтических генов.
Introduction
Гиперактивный SB100X Транспозаза, в сочетании с transposon на основе T2 уже используется в доклинических гена терапии приложения1,2,3, геном модификации4,5, и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) перепрограммирования6,7. Как правило компоненты SB временно предоставляемые плазмида transfection и сильный промоутер учредительный диски выражение Транспозаза. Однако несмотря на улучшение новых методов трансфекции, поставка системы 2 компонентных остается проблемой для многих приложений. Таким образом разработка нового протокола доставки имеет растущий интерес. Помимо методов трансфекции для плазмида8 и мРНК9, вирусный доставки на основе аденовирусных10,11аденоассоциированный вирусный (AAV)12, бакуловирусы13, gammaretroviral14 и в прошлом был предложен лентивирусные векторы15 . В частности системы выбора должны гарантировать переходных доставки компонентов SB без интеграции вирусный вектор. Тем не менее учредительный выражение Транспозаза поднимает проблемы безопасности ввиду опасности неконтролируемого rehopping transposon.
Таким образом регуляцию SB100X системой изысканный тет-ON является первой задачей. Клонированные изменение тет отзывчивым промоутер, полученные путем замены оригинального промоутер развитых минимальной цитомегаловирусом (CMV) с минимальными промоутер (-81) гена Timidine киназы (ТЗ) вирус простого герпеса-1 (ВПГ-1)16, вверх по течению КДНК SB100X (pTetOTKSB100X). Мутировавшие реверс тетрациклин transactivator rtTA2s–17 м2 выражается под контролем сильного учредительный промоутер (phosphoglycerate промоутер, ПГК) клонирован в различных плазмида (НКПС PGKrtTA2S-м2). При добавлении к питательной среды, dox связывает rtTA2s-модулятор м2 и тросов тет промоутер сложных или, полученный в жестко регулируемых индукции SB100X выражение18.
Вторая основная задача возникает от неэффективных transfection клетки человека первичной несколько физических и химических методов. Для эффективной доставки Транспозаза в клетках человека устойчив к трансфекции, SB100X и rtTA2s-м2 выражение кассеты упаковываются в два интеграции дефектных лентивирусные векторы (IDLVs)19: IDLVTKSB и IDLVrtTA2s– М2. Вирусных векторов временно производятся как третьего поколения векторов в HEK293T клетки20 и pseudotyped с гликопротеина G вируса Vescicular стоматит (VSV-G), который предоставляет широкий спектр инфекции. Вектор частицы сосредоточены на ultracentrifugation и титруют immunocapture p24 Gag ВИЧ-1. Передавать линии клетки и клетки первичной, вектор частицы complexed с Полибрен и инкубируют с клеток-мишеней в наличие или отсутствие dox. Снадобь зависимо активации выражения SB100X в transduced клетках измеряется количественного RT-PCR (qRT ПЦР)18.
После того, как продемонстрировал тет регулируется SB100X выражение, транспонирования ГОИ (например, Зеленый флуоресцирующий белок, GFP) в целевой ячейке геном следующим молекулярные события, четко схематизируются бак и Миккельсен21. Третий IDLV вектор, перевозящих что выражение кассету для ГОИ, клонированные между IRs T2-transposon (IDLVT2) должен быть построен и упакованы как упомянуто выше. Наконец три IDLV векторов может использоваться эффективно передают клетки человека (например, первичной кератиноцитов) в пробирке и интегрировать ГОИ присутствии доксициклин18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описываем широко доступной методологии стабильно интегрировать ГОЙ в геном клетки-мишени, Спящая красавица-опосредованной транспонирования. Хотя для обеспечения синцитиального метод для изменения генома была разработана система SB, эффективности механизма интеграции (?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Zappavigna профессор, Университет Модены и Реджо-Эмилии, Модена, Италия для предоставления нам НКПС PGKrtTA2S-плазмида м2. Мы также признаем профессор з. Ivics (Институт Пауля Ehlrich, Ланген, Германия) и профессор з. Izvak (центр Макса Дельбрюка молекулярной медицины, Берлин, Германия) для pCMVSB100X и pT2/BH плазмид. Эта работа была поддержана Дебра международного и итальянского министерства университетов и исследований.
Materials
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium with 4.5g/L glucose w/o L-Glutamine | Lonza | BE12-614F | Cell culture medium. |
| HyClone Fetal Bovine Serum (U.S.), Characterized | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.03 | Serum used HEK293T cell culture for lentiviral particle production. |
| Penicillin 10.000 UI/ml Streptomycin 10.000 UI/ml | Lonza | DE17-602E | Reagents for cell culture medium. |
| L-Glutamine 200mM | Lonza | BE17-605E | Reagent for cell culture medium. |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | Reagent for HBS 2X preparation. |
| HEPES Buffer, 1M Stock in normal saline | Lonza | BE17-737E | Reagent for HBS 2X preparation. |
| Disodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4·2H2O), 99.5% | Merck | 106580 | Reagent for HBS 2X preparation. |
| Hydrochloric acid – ACS reagent 37% (HCl) | Sigma-Aldrich | 320331 | Reagent for HBS 2X preparation. |
| Sterile water for injection | Fresenius Kabi | – | Reagent for HBS 2X preparation. |
| 0.45 µm PESS filter | Whatman | 10462100 | Filters used to remove cell debris from viral supernatant. |
| Polyallomer Beckman tubes | Beckman Coulter | 326823 | Tubes for concentrating IDLV vectors by ultracentrifugation. |
| PBS-1X w/o Ca, Mg | Lonza | BE17-516F | Buffer for cell wash and lentiviral particle resuspension. |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | (Optional) Buffer for lentiviral particle resuspension. |
| HIV-1 Gag p24 immunocapture kit | Perkin Elmer | NEK50001KT | Kit for IDLV particle titration. |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | 107689 | Reagent to enhance transduction efficiency. |
| Trypsin (10X) 2.5% in HBSS w/o Ca, Mg | GIBCO | BE17-160E | Reagent to detach HeLa cells (stock solution, to be diluted). |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) | 100938B | AnalaR BDH | Reagent for trypsin working solution preparation. |
| 0.5% Trypsin-EDTA, no phenol red (10X) | GIBCO | 15400-054 | Reagent to detach keratinocytes (stock solution, to be diluted). |
| Donor Bovine Serum, New Zealand Origin | GIBCO | 16030-074 | Serum for Swiss mouse 3T3-J2 cell culture (feeder layer). |
| Ham’s F12 media | GIBCO | 21765 | Medium for keratinocytes. |
| Fetal bovine serum | Lonza | DE14-801F | Serum for HeLa cell culture medium. |
| Fetal Bovine Serum, qualified, Australia Origin | GIBCO | 10099-141 | Serum for human primary keratinocyte culture medium. |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I5500 | Reagents for keratinocyte growth. |
| Adenine | VWR | 1152-25 | Reagents for keratinocyte growth. |
| Hydrocortisone | VWR | 3867-1 | Reagents for keratinocyte growth. |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Sigma-Aldrich | C8052 | Reagents for keratinocyte growth. |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T5516 | Reagents for keratinocyte growth. |
| Human EGF | Austral Biological | GF-010-9 | Reagents for keratinocyte growth. |
| Mouse monoclonal APC-conjugated Anti-Feeder antibody | Miltenyi Biotech | 130-096-099 | To label feeder layer. |
| RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | RNA purification kit. |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Life Technologies | 18080051 | Reverse transcriptase kit. |
| Deoxynucleotide Mix, 10 mM (dNTP) | Sigma-Aldrich | D7295 | Reagent for semi-quantitative PCR. |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | (any) | – | Reagent for semi-quantitative PCR and for qRT-PCR. |
| GoTaq G2 Hot Start Polymerase | Promega | M740B | Taq polymerase. |
| Agarose, for molecular biology | Sigma-Aldrich | A9539 | Reagent for agarose gel electrophoresis. |
| UltraPure TBE Buffer, 10X | Invitrogen | 15581028 | Reagent for agarose gel electrophoresis, to be dilute (1X) in ddH2O. |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | Reagent for agarose gel electrophoresis. |
| Doxycycline | Sigma-Aldrich | D-9891 | drug to induce transposase expression in HeLa cells and in keratinocytes |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystem | 4304437 | TaqMan Universal PCR Master Mix including primers and probe. |
| 15mL High Clarity polypropylene Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, Sterile | Falcon Corning | 352096 | Tubes for cell collection and vector dilution preparation. |
| 150 mm TC-Treated Cell Culture Dish with 20 mm Grid, Sterile | Falcon Corning | 353025 | Cell culture dish for viral production. |
| 6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid, Individually Wrapped, Sterile | Falcon Corning | 353046 | Cell culture plate for HeLa and human primary keratinocyte transduction. |
| Safe-Lock microcentrifuge tubes, volume 1.5 mL | Eppendorf | 0030 120.086 | Tubes for dilution preparation. |
| Safe-Lock microcentrifuge tubes, volume 2 mL | Eppendorf | 0030 120.094 | Tubes for dilution preparation. |
| 0.2ml PCR Tubes with flat caps, RNase, DNase, DNA and PCR Inhibitor free | (any) | – | Tubes for semi-quantitative PCR. |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL | Applied Biosystem | 4346906 | 96-well for qRT-PCR. |
| 5mL Round Bottom Polystyrene Tube, without Cap | BD Falcon | 352052 | Tubes for flow cytometry acquisition. |
| Disposable Serological Pipets, Polystyrene, Individually Wrapped, Sterile (different volumes) | (any) | – | Pipettes for sterile tissue culture applications. |
| Filter Tips, Sterile, and RNase, DNase, DNA and Pyrogen free (different volumes) | (any) | – | Filter tips for sterile tissue colture and molecular biology applications. |
| pH meter | (any) | – | Equipment for measurement of HBS 2X pH. |
| PCR Thermal cycler | (any) | – | Equipment for semi-quantitative PCR. |
| Agarose gel electrophoresis equipment | (any) | – | Equipment for agarose gel electrophoresis of semi-quantitative PCR. |
| BD FACS Canto II 2LSR 4/2 | BD | – | Flow cytometer. |
| 7900HT Fast Real-Time PCR system | Applied Biosystem | 7900HT | Equipment for qRT-PCR. |
| Benchtop centrifuges for efficient sample processing in cell culture applications, refrigerated, with microplate buckets. | (any) | – | Centrifuge for cell culture processing and spinoculation. |
| Optima L-90K Ultracentrifuge equipped with SW32TI rotor | Beckman Coulter | – | Ultracentrifuge for lentiviral particle production. |
| Equipment for cell culture and molecular biology laboratory (e.g., Class II laminar flow hood designed for work involving BSL2 materials, cell culture incubator,refrigerators and freezers (+4 °C, -20 °C, -80 °C), micropipettes and pipet-aid). | |||
| Protective laboratory coats, gloves, face protection in accordance with Institute rules and regulations, in particular for lentiviral particle production and transduction. | |||
Referências
- Mates, L., et al. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nat Genet. 41 (6), 753-761 (2009).
- Maiti, S. N., et al. Sleeping beauty system to redirect T-cell specificity for human applications. J Immunother. 36 (2), 112-123 (2013).
- Johnen, S., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (8), 4787-4796 (2012).
- Koso, H., et al. Transposon mutagenesis identifies genes that transform neural stem cells into glioma-initiating cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (44), E2998-E3007 (2012).
- Belay, E., et al. Novel hyperactive transposons for genetic modification of induced pluripotent and adult stem cells: a nonviral paradigm for coaxed differentiation. Stem Cells. 28 (10), 1760-1771 (2010).
- Grabundzija, I., et al. Sleeping Beauty transposon-based system for cellular reprogramming and targeted gene insertion in induced pluripotent stem cells. Nucleic Acids Res. 41 (3), 1829-1847 (2013).
- Kues, W. A., et al. Derivation and characterization of sleeping beauty transposon-mediated porcine induced pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 22 (1), 124-135 (2013).
- Turchiano, G., et al. Genomic analysis of Sleeping Beauty transposon integration in human somatic cells. PLoS One. 9 (11), e112712 (2014).
- Jin, Z., et al. The hyperactive Sleeping Beauty transposase SB100X improves the genetic modification of T cells to express a chimeric antigen receptor. Gene Ther. 18 (9), 849-856 (2011).
- Latella, M. C., et al. Correction of Recessive Dystrophic Epidermolysis Bullosa by Transposon-Mediated Integration of COL7A1 in Transplantable Patient-Derived Primary Keratinocytes. J Invest Dermatol. 137 (4), 836-844 (2017).
- Zhang, W., et al. Integration profile and safety of an adenovirus hybrid-vector utilizing hyperactive sleeping beauty transposase for somatic integration. PLoS One. 8 (10), e75344 (2013).
- Zhang, W., et al. Hybrid adeno-associated viral vectors utilizing transposase-mediated somatic integration for stable transgene expression in human cells. PLoS One. 8 (10), e76771 (2013).
- Turunen, T. A., Laakkonen, J. P., Alasaarela, L., Airenne, K. J., Yla-Herttuala, S. Sleeping Beauty-baculovirus hybrid vectors for long-term gene expression in the eye. J Gene Med. 16 (1-2), 40-53 (2014).
- Galla, M., et al. Avoiding cytotoxicity of transposases by dose-controlled mRNA delivery. Nucleic Acids Res. 39 (16), 7147-7160 (2011).
- Moldt, B., et al. Comparative genomic integration profiling of Sleeping Beauty transposons mobilized with high efficacy from integrase-defective lentiviral vectors in primary human cells. Mol Ther. 19 (8), 1499-1510 (2011).
- Recchia, A., Perani, L., Sartori, D., Olgiati, C., Mavilio, F. Site-specific integration of functional transgenes into the human genome by adeno/AAV hybrid vectors. Mol. Ther. 10, 660-670 (2004).
- Urlinger, S., et al. Exploring the sequence space for tetracycline-dependent transcriptional activators: novel mutations yield expanded range and sensitivity. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (14), 7963-7968 (2000).
- Cocchiarella, F., et al. Transcriptionally regulated and nontoxic delivery of the hyperactive Sleeping Beauty Transposase. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16038 (2016).
- Yanez-Munoz, R. J., et al. Effective gene therapy with nonintegrating lentiviral vectors. Nat Med. 12 (3), 348-353 (2006).
- Dull, T., et al. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
- Bak, R. O., Mikkelsen, J. G. Mobilization of DNA transposable elements from lentiviral vectors. Mob Genet Elements. 1 (2), 139-144 (2011).
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular Cloning: A laboratory Manual. , (2012).
- Dellambra, E., et al. Corrective transduction of human epidermal stem cells in laminin-5-dependent junctional epidermolysis bullosa. Hum Gene Ther. 9, 1359-1370 (1998).
