Une méthode de Transposition efficace In Vitro par un système de beauté dormir transcriptionnellement réglementé empaquetée dans un vecteur Lentiviral défectueux de l’intégration

Summary

Ce protocole décrit une méthode pour réaliser l’intégration stable d’un gène d’intérêt dans le génome humain par le système transcriptionnellement réglementé de la Belle au bois dormant . Préparation de l’intégration des vecteurs LENTIVIRAUX défectueux, la transduction in vitro des cellules humaines et l’analyse moléculaire sur les cellules transduits sont signalés.

Abstract

Le transposon de Belle au bois dormant (SB) est un système intégrant non viraux avec une efficacité prouvée pour transfert génétique et la génomique fonctionnelle. Pour optimiser les machines de transposon SB, une transposase hyperactif transcriptionnellement réglementé (SB100X) et le transposon axée sur le T2 sont employés. En règle générale, la transposase et transposons sont fournis transitoirement par transfection de plasmide et expression SB100X est pilotée par un promoteur constitutif. Nous décrivons ici une méthode efficace pour fournir les composants SB aux cellules humaines qui sont résistantes à plusieurs méthodes de transfection physiques et chimiques, pour contrôler l’expression SB100X et stablement intégrer un gène d’intérêt (IGE) à travers un « copier / coller » SB mécanisme. L’expression de la transposase hyperactif est étroitement contrôlée par le système Tet-ON, largement utilisé pour contrôler l’expression des gènes depuis 1992. Le gène d’intérêt est flanqué des séquences inversées répétées (IR) du transposon T2. Les deux composantes de SB sont emballés dans l’intégration des vecteurs LENTIVIRAUX défectueux transitoirement produites dans les cellules HEK293T. Les cellules humaines, les lignées cellulaires ou cellules primaires provenant de tissus humains, sont en vitro transitoirement transduites avec des vecteurs viraux. Lors de l’addition de la doxycycline (dox, tétracycline analogique) dans le milieu de culture, un réglage fin de l’expression de la transposase est mesurée et se traduit par une intégration durable du gène d’intérêt dans le génome des cellules traitées. Cette méthode est efficace et applicable à la lignée cellulaire (par exemple, les cellules HeLa) et les cellules primaires (p. ex., les kératinocytes humains primaires) et représente donc un outil précieux pour le génie génétique et transfert de gènes thérapeutiques.

Introduction

La transposase SB100X hyperactive, couplée à du transposon axée sur le T2 a déjà été utilisée dans le gène précliniques thérapie demandes^1,2,3, génome modifications^4,5, et cellules souches pluripotentes induites (iPSC) reprogrammation^6,7. En règle générale, les éléments de SB sont transitoirement fournis par transfection de plasmide et un promoteur constitutif fort conduit à l’expression de la transposase. Toutefois, malgré l’amélioration des nouvelles méthodes de transfection, livraison du système bi-composant demeure un défi pour de nombreuses applications. Ainsi, le développement d’un nouveau protocole de livraison a un intérêt croissant. En plus de méthodes de transfection pour plasmide ARNm et^{8 9}, livraison viral basé sur adénoviraux^10,11, adeno-associated virus (AAV)¹², Baculovirus¹³, gammaretroviral¹⁴ et vecteurs LENTIVIRAUX¹⁵ a été proposé dans le passé. Notamment, le système de choix doit garantir une prestation transitoire des composants SB sans intégration du vecteur viral. Néanmoins, l’expression constitutive de la transposase soulève des questions de sécurité en raison du risque de rehopping incontrôlable du transposon.

Par conséquent, la régulation transcriptionnelle de SB100X par un système raffiné de Tet-ON est le premier défi. Mis à jour le promoteur Tet-sensible, obtenu en remplaçant le promoteur développés minime cytomégalovirus (CMV) original avec le promoteur minimal (-81) du gène du Virus Herpès Simplex 1 (HSV1)¹⁶, Timidine Kinase (TK) par est cloné en amont de la SB100X ADNc (pTetOTKSB100X). La mutation inverse-tétracycline-transactivateur rtTA2^s-M2¹⁷ est exprimée sous le contrôle du promoteur constitutif fort (promoteur phosphoglycérate, PGK) cloné dans un plasmide différent (VR-PGKrtTA2^S-M2). Lors de l’ajout au milieu de culture, dox lie la rtTA2^s-modulateur M2 et longes le promoteur Tet ou complex, consistant en une induction étroitement réglementée de SB100X expression¹⁸.

Le deuxième grand défi découle de l’inefficacité transfection de cellules humaines primaires par plusieurs méthodes physiques et chimiques. Pour délivrer efficacement la transposase dans les cellules humaines résistants à la transfection, les SB100X et les rtTA2^s-cassettes d’expression M2 sont emballés dans deux intégration des vecteurs LENTIVIRAUX défectueux (IDLVs)¹⁹: IDLVTKSB et IDLVrtTA2^s– M2. Vecteurs viraux sont transitoirement produits des vecteurs troisième génération de cellules HEK293T²⁰ et Pseudo avec la glycoprotéine G du Virus de la stomatite vésiculeuse (VSV-G), qui lui confère un large spectre de l’infection. Particules de vecteur sont concentrées par ultracentrifugation et titrés par immunocapture de p24 VIH-1 Gag. Pour transmettre des lignées cellulaires et les cellules primaires, particules de vecteur sont complexés avec polybrene et sont incubés avec cellules cibles en présence ou en absence de dox. Activation de toxicomanes de SB100X expression dans les cellules transduits est mesurée par quantitative RT-PCR (qRT-PCR)¹⁸.

Une fois que l’expression SB100X Tet réglementés est démontrée, transposition des IgE (p. ex., protéine fluorescente verte, GFP) dans le génome de cellule cible suit les événements moléculaires clairement schématisées par Bak et Mikkelsen²¹. Une troisième jusque vecteur transportant une cassette d’expression pour les pouvoirs publics indiens cloné entre l’IRs T2-transposon (IDLVT2) doit être construit et conditionnés comme indiqué ci-dessus. Enfin, les trois vecteurs jusque peuvent être utilisés efficacement transduce (p. ex., les kératinocytes primaires) des cellules humaines in vitro et intégrer le gouvernement de l’Inde en présence de doxycycline,¹⁸.

Protocol

1. les plasmides employées NOTE : Plasmide VR-PGKrtTA2S-M2 a été aimablement fournie par Prof. Zappavigna (Université de Modène et Reggio Emilia, Modène, Italie). Le plasmide de pCMVSB100X portant la séquence codante de la transposase hyperactif et plasmide transposon pT2/BH ont été gracieusement fournis par Prof Z. Ivics (l’Institut Paul Ehrlich, Langen, Allemagne) et le Prof. Z. Izvak (Centre Max Delbrück de médecine moléculaire, Berlin, (Allemagne). Pour …

Representative Results

À l’aide de la procédure présentée ici, trois vecteurs jusque supportant les composants réglementés de SB (SB100X, rtTA2S-transposon M2 et T2-GFP) ont été emballés et permettant de délivrer efficacement et étroitement réglementer le système SB dans les cellules humaines. Figure 1 a présente un schéma pour in vitro transduction des cellules HeLa, qui a été réalisée pour évaluer la régulation transcriptionnelle de SB t…

Discussion

Nous décrivons ici une méthodologie largement accessible pour un GOI stablement intégrer le génome des cellules cibles de la Belle au bois dormant-médiée par transposition. Bien que le système de SB a été développé pour fournir une méthode nonviral pour l’édition de génome, une prestation efficace de la machinerie de l’intégration (transposase et T2 transposon) est obligatoire. Par conséquent, pour utiliser le système SB sur peine transfectable cellules primaires, une livraison virale des co…

Materials

Dulbecco’s modified Eagle’s medium with 4.5g/L glucose w/o L-Glutamine	Lonza	BE12-614F	Cell culture medium.
HyClone Fetal Bovine Serum (U.S.), Characterized	GE Healthcare Life Sciences	SH30071.03	Serum used HEK293T cell culture for lentiviral particle production.
Penicillin 10.000 UI/ml Streptomycin 10.000 UI/ml	Lonza	DE17-602E	Reagents for cell culture medium.
L-Glutamine 200mM	Lonza	BE17-605E	Reagent for cell culture medium.
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	Reagent for HBS 2X preparation.
HEPES Buffer, 1M Stock in normal saline	Lonza	BE17-737E	Reagent for HBS 2X preparation.
Disodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4·2H2O), 99.5%	Merck	106580	Reagent for HBS 2X preparation.
Hydrochloric acid – ACS reagent 37% (HCl)	Sigma-Aldrich	320331	Reagent for HBS 2X preparation.
Sterile water for injection	Fresenius Kabi	–	Reagent for HBS 2X preparation.
0.45 µm PESS filter	Whatman	10462100	Filters used to remove cell debris from viral supernatant.
Polyallomer Beckman tubes	Beckman Coulter	326823	Tubes for concentrating IDLV vectors by ultracentrifugation.
PBS-1X w/o Ca, Mg	Lonza	BE17-516F	Buffer for cell wash and lentiviral particle resuspension.
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153	(Optional) Buffer for lentiviral particle resuspension.
HIV-1 Gag p24 immunocapture kit	Perkin Elmer	NEK50001KT	Kit for IDLV particle titration.
Polybrene	Sigma-Aldrich	107689	Reagent to enhance transduction efficiency.
Trypsin (10X) 2.5% in HBSS w/o Ca, Mg	GIBCO	BE17-160E	Reagent to detach HeLa cells (stock solution, to be diluted).
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA)	100938B	AnalaR BDH	Reagent for trypsin working solution preparation.
0.5% Trypsin-EDTA, no phenol red (10X)	GIBCO	15400-054	Reagent to detach keratinocytes (stock solution, to be diluted).
Donor Bovine Serum, New Zealand Origin	GIBCO	16030-074	Serum for Swiss mouse 3T3-J2 cell culture (feeder layer).
Ham’s F12 media	GIBCO	21765	Medium for keratinocytes.
Fetal bovine serum	Lonza	DE14-801F	Serum for HeLa cell culture medium.
Fetal Bovine Serum, qualified, Australia Origin	GIBCO	10099-141	Serum for human primary keratinocyte culture medium.
Insulin from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	I5500	Reagents for keratinocyte growth.
Adenine	VWR	1152-25	Reagents for keratinocyte growth.
Hydrocortisone	VWR	3867-1	Reagents for keratinocyte growth.
Cholera Toxin from Vibrio cholerae	Sigma-Aldrich	C8052	Reagents for keratinocyte growth.
Triiodothyronine	Sigma-Aldrich	T5516	Reagents for keratinocyte growth.
Human EGF	Austral Biological	GF-010-9	Reagents for keratinocyte growth.
Mouse monoclonal APC-conjugated Anti-Feeder antibody	Miltenyi Biotech	130-096-099	To label feeder layer.
RNeasy Plus Mini Kit	Qiagen	74134	RNA purification kit.
SuperScript III Reverse Transcriptase	Life Technologies	18080051	Reverse transcriptase kit.
Deoxynucleotide Mix, 10 mM (dNTP)	Sigma-Aldrich	D7295	Reagent for semi-quantitative PCR.
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	(any)	–	Reagent for semi-quantitative PCR and for qRT-PCR.
GoTaq G2 Hot Start Polymerase	Promega	M740B	Taq polymerase.
Agarose, for molecular biology	Sigma-Aldrich	A9539	Reagent for agarose gel electrophoresis.
UltraPure TBE Buffer, 10X	Invitrogen	15581028	Reagent for agarose gel electrophoresis, to be dilute (1X) in ddH2O.
Ethidium bromide	Sigma-Aldrich	E1510	Reagent for agarose gel electrophoresis.
Doxycycline	Sigma-Aldrich	D-9891	drug to induce transposase expression in HeLa cells and in keratinocytes
TaqMan Universal PCR Master Mix	Applied Biosystem	4304437	TaqMan Universal PCR Master Mix including primers and probe.
15mL High Clarity polypropylene Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, Sterile	Falcon Corning	352096	Tubes for cell collection and vector dilution preparation.
150 mm TC-Treated Cell Culture Dish with 20 mm Grid, Sterile	Falcon Corning	353025	Cell culture dish for viral production.
6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid, Individually Wrapped, Sterile	Falcon Corning	353046	Cell culture plate for HeLa and human primary keratinocyte transduction.
Safe-Lock microcentrifuge tubes, volume 1.5 mL	Eppendorf	0030 120.086	Tubes for dilution preparation.
Safe-Lock microcentrifuge tubes, volume 2 mL	Eppendorf	0030 120.094	Tubes for dilution preparation.
0.2ml PCR Tubes with flat caps, RNase, DNase, DNA and PCR Inhibitor free	(any)	–	Tubes for semi-quantitative PCR.
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL	Applied Biosystem	4346906	96-well for qRT-PCR.
5mL Round Bottom Polystyrene Tube, without Cap	BD Falcon	352052	Tubes for flow cytometry acquisition.
Disposable Serological Pipets, Polystyrene, Individually Wrapped, Sterile (different volumes)	(any)	–	Pipettes for sterile tissue culture applications.
Filter Tips, Sterile, and RNase, DNase, DNA and Pyrogen free (different volumes)	(any)	–	Filter tips for sterile tissue colture and molecular biology applications.
pH meter	(any)	–	Equipment for measurement of HBS 2X pH.
PCR Thermal cycler	(any)	–	Equipment for semi-quantitative PCR.
Agarose gel electrophoresis equipment	(any)	–	Equipment for agarose gel electrophoresis of semi-quantitative PCR.
BD FACS Canto II 2LSR 4/2	BD	–	Flow cytometer.
7900HT Fast Real-Time PCR system	Applied Biosystem	7900HT	Equipment for qRT-PCR.
Benchtop centrifuges for efficient sample processing in cell culture applications, refrigerated, with microplate buckets.	(any)	–	Centrifuge for cell culture processing and spinoculation.
Optima L-90K Ultracentrifuge equipped with SW32TI rotor	Beckman Coulter	–	Ultracentrifuge for lentiviral particle production.
Equipment for cell culture and molecular biology laboratory (e.g., Class II laminar flow hood designed for work involving BSL2 materials, cell culture incubator,refrigerators and freezers (+4 °C, -20 °C, -80 °C), micropipettes and pipet-aid).
Protective laboratory coats, gloves, face protection in accordance with Institute rules and regulations, in particular for lentiviral particle production and transduction.